[发明专利]一种牙鲆精巢细胞系的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及海水鱼类细胞培养技术，具体说是一种牙鲆精巢细胞系的构建方法。

背景技术

构建与培养动物细胞系早已成为研究内分泌学、毒理学、遗传学、病毒学、免疫学、肿瘤治疗的有力工具。截至目前已有近280余株不同的鱼类细胞系相继建立起来，而海水鱼类及咸水鱼类的细胞系仅有约100株，远远不能满足其在生理学、病毒学、毒理学、肿瘤及基因工程等多个领域的应用需求。

牙鲆(Paralichthys olivaceus)，属硬骨鱼纲、辐鳍亚纲、鲽形目、鲽亚目、牙鲆科、牙鲆属。其肉质鲜嫩，是重要的海水增养殖鱼类之一。与大多数鲆鲽鱼相似，雌性鱼个体比相应的雄性个体大的特性使得全雌养殖倍受重视。牙鲆的性染色体属于XX-XY型，至今未找到性染色体和性别决定基因(Fujiwara等，2007)，其性别表型的形成是由遗传和环境因子协同作用而致(GSD+TSD，Luckenbach等，2009)。有关牙鲆性别分化分子生物学的研究，目前国内外学者研究多注重于性别相关基因的克隆和表达谱分析，缺乏深入地探讨。其中，牙鲆性腺来源细胞系的缺乏，限制了其性别相关基因的功能研究以及性别表达调控机制的揭示。同时，近年来，随着环境污染日益加剧和养殖业过度膨胀，病害问题造成严重的经济损失，极大影响了牙鲆养殖业的健康发展。因此，伴随着性别控制和病害防治研究的深入，体外分离培养牙鲆细胞的应用意义日益凸显。但是，迄今为止，国内外仅有牙鲆鳍条细胞系(中国海洋大学，童裳亮，Aquaculture,1997,156:327-333)、胚胎细胞系(中国水产研究院黄海水产研究所，陈松林，Diseases of Aquatic Organisms,2004,60:241-246)、肾脏细胞系(中国水产研究院黄海水产研究所，王娜，Journal of Fish Diseases,2011,34:81-85)和申请人所在实验室建立的脑细胞系、肌卫星细胞系等5个细胞系，未见有该鱼种性腺组织细胞系建立的报道。因此，体外培养的精巢细胞将成为研究牙鲆性别相关基因功能、性别分化及病害防治的重要研究平台。

发明内容

本发明的目的在于提供一种培养操作简便的牙鲆精巢细胞系的构建方法。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种牙鲆精巢细胞系的构建方法：

(1)原代培养：取健康雄鱼精巢于DF12培养基(含400U/mL青霉素，400μg/mL链霉素)中，PBS清洗后将精巢组织充分剪碎，并加入胰蛋白酶消化，而后用细胞培养液充分悬浮，离心收集沉淀，向沉淀中加入细胞培养液使其悬浮，25±0.2℃培养箱正置培养；次日，待组织块完成贴壁后小心补加细胞培养液；

(2)传代培养：待原代培养组织块周围细胞迁出、增殖至形成巢式细胞晕时，加入0.25％胰蛋白酶消化悬起细胞，利用细胞培养液进行原瓶初次传代培养,待原瓶传代细胞长满瓶底后，以1:1-1:2(v/v)分瓶传代，以后7-10d传代一次；传至10代后将细胞培养液中的血清含量减为细胞培养液总体积的10％，目前，该细胞已经传至40余代(42-47代)，细胞系建立成功；

所述细胞培养液为在DF12培养液中加入占细胞培养液总体积20％的胎牛血清，10ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子(Recombinant Human FGFb，bFGF)，15ng/ml重组人表皮生长因子(Recombinant Human EGF，EGF)，pH值为7.2-7.4，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，4℃存放，备用。

步骤(1)中清洗后精巢组织剪成糜状。

在步骤(1)中精巢组织剪成糜状后，加入0.25(wt)％胰蛋白酶消化10min。

在步骤(1)培养中的精巢组织外植体小块经短暂消化和离心收集后，先用细胞培养液悬浮后在培养箱中正置过夜培养，待组织块贴壁，第二天再补加细胞培养液。

在步骤(2)中，细胞初次传代时将吸出的旧培养基转入一备用离心管内，待细胞消化完成后在新鲜培养液中加入备用离心管内的旧培养液制备1:1(v/v)比例细胞悬液进行传代。

本发明所具有的优点和积极效果如下：