[发明专利]一种固定化转氨酶及其在合成西他列汀中间体中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种固定化转氨酶，该固定化转氨酶的制备方法，以及该固定化转氨酶作为催化剂在不对称合成西他列汀中间体中的应用。

背景技术

酶是一类由生物体产生的具有催化功能的生物大分子物质，作为一种生物催化剂，酶在常温常压的温和条件下能催化各种有机化学反应。酶催化具有高效性，比一般催化剂的效率高出10⁷～10¹³倍；酶催化具有很高的专一性，可以减少或避免副反应，得到很高纯度的产物；酶催化反应还具有很高的立体选择性和区域选择性，无需保护与脱保护。酶的这些优点大大促进了人们对酶的应用和酶技术的研究。但是，由于酶绝大多数属于蛋白质，其高级结构对环境十分敏感，各种因素如物理因素(温度、压力、电磁场等)、化学因素(氧化、还原、有机溶剂、金属离子、离子强度、pH等)和生物因素(酶修饰和酶降解等)均有可能使其丧失生物活性。即使在最适条件下，酶也会逐渐失活，随着反应时间的延长，反应速度会逐渐下降；此外，反应后酶不能回收，只能采用分批法进行生产，这对于现代生物催化工业来说，成本较高。

为了解决以上问题，人们设计了一种固定化酶，就是将酶束缚于某种特殊的介质中，使它与反应体系分开，但仍能与底物进行分子交换。这种固定化酶与一般的固体化学催化剂一样，既具有催化特性，又具有能回收、反复使用等优点，生产工艺也可以实现连续化、自动化。

固定化酶的固定化方法包括吸附法、包埋法、交联法与共价结合法。其中，吸附法又可以分为物理吸附法与离子吸附法两种，该方法条件温和，酶活损失少，易于再生，但是固定得不牢固，非常容易解吸附。包埋法主要采用海藻酸钙、卡拉胶、聚丙烯酰胺、尼龙膜或硝酸纤维素微囊包埋，该方法一般较为温和，酶活性损失少，但是传质阻力很大，不利于较大分子或很低溶解度底物的催化。交联法中用的最多的是戊二醛交联，一般操作较为简便，但是反应剧烈，酶活损失大；而且机械性能差，颗粒度细，难以分离。共价结合法常用芳胺载体的重氮化反应、羟基载体的溴化氰-亚胺碳酸盐反应、羧基载体的羰二亚胺反应、巯基载体的二硫键交换反应等，由于其结合牢固、稳定性好等特点，是目前研究与应用最为广泛的一类方法。但是该方法条件苛刻，反应剧烈，酶活损失大(一般残余酶活在30％左右)。

西他列汀磷酸盐由默克公司开发，于2006年8月及10月分别被墨西哥卫生部及美国FDA批准为治疗II型糖尿病的药物，商品名为捷诺维(Januvia)，目前已经在全世界60多个国家批准使用，2012年销售额已达40.86亿美元，同比增长23％。因此，西他列汀磷酸盐是属于国际最新且附加值极高的“重磅炸弹”，其合成的关键是手性胺中心的构建。

美国专利US8293507公开了Codexis公司对节杆菌来源的转氨酶进行改造得到的生物催化剂来构建手性胺中心，转氨化产物ee值达到99％，底物投料100g/L。但是由于底物水溶性差，需要添加高达50％的DMSO助溶，使得产品的后处理损失较大，DMSO的溶剂残余较高，回收困难，成本较高。

而后默克公司在中国专利申请CN103608355A中公开了利用环氧树脂对该酶进行固定化，使得反应得以在水饱和的乙酸异丙酯中进行反应，但是并未公布该酶进行固定化的酶活回收率。

中国专利申请CN103014081A公开了苏州汉酶公司利用转氨酶将3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯转化为R-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯，但是并没有公开具体转氨酶的序列以及克隆方法。

中国专利申请号201410169882.4公开了本公司运用来源于分支杆菌(Mycobacterium vanbaalenii)PYR-1的转氨酶对3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯的不对称转氨化反应，由于该底物水溶性较高，因此具有较高的时空产率，具有一定的工业化应用价值。但是，游离酶反应使得分离困难，不能重复利用。

发明内容

本发明针对来源于分支杆菌(Mycobacterium vanbaalenii)PYR-1的转氨酶在酶催化过程中分离困难，以及酶固定化过程中存在的酶活性损失大或传质困难等问题，将海藻酸钠与带组氨酸标签的分支杆菌(Mycobacterium vanbaalenii)PYR-1来源的转氨酶进行固定化，并用氯化钙溶液进行处理得到固定化转氨酶。该固定化方法反应温和，酶活基本无损失。运用该固定化酶对底物3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯进行不对称转氨，可以重复利用20批次，且分离简单。