[发明专利]一种基于核酸适体的水胺硫磷和丙溴磷的荧光检测方法

权利要求书

1.一种基于核酸适体的水胺硫磷和丙溴磷的荧光检测方法，基于核酸适体结构转换信号，其特征是包括如下步骤：

1)、将核酸适体F-ssDNA与互补序列Q-B杂交；

核酸适体F-ssDNA是5′末端标记荧光基团FAM的识别水胺硫磷和丙溴磷的35个碱基的单链DNA，序列为：

5′-FAM-AGCTTGCTGCAGCGATTCTTGATCGCCACAGAGCT-3′；

互补序列Q-B是3′末端标记DABCYL的15个碱基的单链DNA，序列为：

5′-GAATCGCTGCAGCAA-DABCYL-3′；

互补序列Q-B与核酸适体F-ssDNA杂交的部位从核酸适体5′末端起第4个碱基至第18个碱基，杂交后双链的序列为：

核酸适体F-ssDNA、互补序列Q-B的缓冲溶液为A buffer缓冲体系(A buffer缓冲体系组成为300mmol/L NaCl、50mmol/L KCl、10mmol/L MgCl2、50mmol/L Tris，体系pH值为8.3)；

核酸适体F-ssDNA的浓度为0.1μmol/L，互补序列Q-B的浓度为0.2μmol/L，核酸适体F-ssDNA与互补序列Q-B的摩尔比为1：2，体积比为1：1；

核酸适体F-ssDNA与互补序列Q-B的杂交条件为避光的室温下杂交20min；

2)、加入标准品、样品组进行反应，并预留空白实验作为对照组，标准品含有系列浓度的水胺硫磷和丙溴磷；

对照组、标准品、样品组的缓冲体系为含有1％(体积百分比)丙酮的A buffer缓冲体系，对照组、标准品和样品组与步骤1)杂交后体系的体积比均为1：1，杂交后体系与标准品、样品组反应时间为60min；

样品组的前处理步骤为：取待测蔬菜样品，擦去表面泥土后研碎，取1g放入试管中，加入5mL丙酮，室温下超声波振荡提取10min，过滤，在沸水浴上将丙酮挥发干，用1mL含有1％丙酮的A buffer振荡溶解提取物，过0.45μm滤膜后待测；

3)、检测各体系的荧光强度，计算荧光强度的变化；

取体积为100μL的检测样液，加入黑色96孔板，在多功能读板机上进行，激发波长为485nm、发射波长为535nm；

4)、建立标准曲线，确定最低检出限和线性范围；

对水胺硫磷的检测线性范围为50-500μmol/L，线性回归方程为y＝227.20x+33325，线性回归系数为0.9978，检出限为30.224μmol/L；对丙溴磷的检测线性范围为100-500μmol/L，线性回归方程为y＝195.20x-18519，线性回归系数为0.9975，检出限为86.874μmol/L。