[发明专利]一种基于核酸适体的水胺硫磷和丙溴磷的荧光检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是一种基于核酸适体的水胺硫磷和丙溴磷的荧光检测方法。

背景技术

有机磷农药是我国杀虫剂的主体，国家标准规定农产品中有机磷农药的最大允许残留量为0.2mg/kg(GB/T5009.199-2003)。水胺硫磷为高毒禁用的农药，丙溴磷为限量使用的有机磷农药。但近年来，由于农药的不合理的使用，导致农产品中农药残留严重超标，引起的食物中毒事件逐渐增多，已严重的危害到我国的食品安全。2010年的毒豇豆事件就是高毒农药水胺硫磷的超范围使用引起的。农药残留的监控离不开快速、灵敏的检测技术。

核酸适体(Aptamer)是通过SELEX技术，从人工体外合成的随机寡核苷酸序列库中，反复筛选得到的。目前，越来越多的核酸适体在抗生素、重金属食源性致病菌、生物毒素等食品安全检测领域得以成功应用。经过多轮SELEX筛选得到的核酸适体本身不具有信号转换的功能，当其与靶分子结合时不能产生可以检测的信号，因此必须经过合理的修饰使其与靶分子特异性识别时能够转换成易于检测的物理信号，才能在分析检测中应用。结构转换信号核酸适体是Nutiu和Li提出的(Nutiu and Li，2003)，他们巧妙的将核酸适体构建到DNA杂交双链体系中，当没有靶标分子存在时，DNA双链的杂交使荧光基团和猝灭基团靠近，荧光基团的荧光被猝灭，荧光强度很低，当靶标分子存在时，由于核酸适体和靶标分子的特异性结合形成适体-靶分子的复合物，使得荧光基团和猝灭基团远离，荧光强度增强。这种方法可以将荧光基团和淬灭基团灵活地设计在不同的杂交位置，非常灵活和方便。

目前核酸适体仿生分子识别体系的研究在国际、国内均受到广泛重视，相关研究进展不断出现，但是在食品安全领域中的应用仍处于起步阶段。

发明内容

为了克服上述现有技术中存在的欠缺之处，本发明要解决的技术问题是提供一种基于核酸适体的水胺硫磷和丙溴磷的荧光检测方法，利用核酸适体的特异性识别作用，建立基于核酸适体结构转换信号的荧光检测方法，实现对水胺硫磷与丙溴磷的检测。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：一种基于核酸适体的水胺硫磷和丙溴磷的荧光检测方法，基于核酸适体结构转换信号，包括如下步骤：

1)、将核酸适体F-ssDNA与互补序列Q-B杂交；

2)、加入标准品、样品组进行反应，并预留空白实验作为对照组，标准品含有系列浓度的水胺硫磷和丙溴磷；

3)、检测各体系的荧光强度，计算荧光强度的变化；

4)、建立标准曲线，确定最低检出限和线性范围；

所述核酸适体F-ssDNA是5′末端标记荧光基团FAM的识别水胺硫磷和丙溴磷的35个碱基的单链DNA，序列为：

5′-FAM-AGCTTGCTGCAGCGATTCTTGATCGCCACAGAGCT-3′；

所述互补序列Q-B是3′末端标记DABCYL的15个碱基的单链DNA，序列为：

5′-GAATCGCTGCAGCAA-DABCYL-3′；

所述互补序列Q-B与核酸适体F-ssDNA杂交的部位从核酸适体5′末端起第4个碱基至第18个碱基，杂交后双链的序列为：

所述步骤1)中核酸适体F-ssDNA、互补序列Q-B的缓冲溶液为A buffer缓冲体系(A buffer缓冲体系组成为300mmol/L NaCl、50mmol/L KCl、10mmol/L MgCl2、50mmol/L Tris，体系pH值为8.3)。

所述步骤1)中核酸适体F-ssDNA的浓度为0.1μmol/L，互补序列Q-B的浓度为0.2μmol/L，核酸适体F-ssDNA与互补序列Q-B的摩尔比为1：2，体积比为1：1。

所述步骤1)中核酸适体F-ssDNA与互补序列Q-B的杂交条件为避光的室温下杂交20min。

所述步骤2)中对照组、标准品、样品组的缓冲体系为含有1％(体积百分比)丙酮的A buffer缓冲体系，对照组、标准品和样品组与步骤1)杂交后体系的体积比均为1：1。

所述步骤2)中的反应时间为60min。

所述步骤3)中荧光强度检测的方法为：取体积为100μL的检测样液，加入黑色96孔板，在多功能读板机上进行，激发波长为485nm、发射波长为535nm。