[发明专利]一种基于免疫金的电化学传感元件的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及电化学技术领域，尤其涉及一种基于免疫金的电化学传感元件的制备方法及其应用。

背景技术

硝基咪唑类抗生素包括甲硝唑、替硝唑、地美硝唑、洛硝哒唑、异丙硝唑等,是畜禽饲料中常用的抗原虫感染及抗菌药,并具有促生长作用,还能与其他抗生素联合使用于治疗厌氧菌感染。但是该类药物及其某些代谢物对哺乳动物具有致癌、致畸、致突变作用和遗传毒性，被许多国家列为违禁药物。在欧盟，洛硝哒、地美硝唑和甲硝唑分别在1993年、1995年和1998年被禁止用于食用动物，2002年美国食品与药物管理局公布了禁止在进口动物源性食品中使用的11种药物,其中包括地美硝唑及其他硝基咪唑类药物。我国农业部和国家药品监督管理局第227号公告规定甲硝唑、地美硝唑及其盐、酯及制剂不准以促进动物生长为目的在所有食品动物饲养过程中使用。

目前在国内，测定硝基咪唑类兽药的方法主要有气相色谱法、气相色谱质谱联用法、高效液相色谱法和高效液相色谱质谱联用法等。但是这些方法的检测设备昂贵、样品前处理复杂，同时还需要较高水平的专业人员进行操作，很难满足对批量样品进行快速检测和现场检测的要求。

近年来，由于免疫传感器技术具有分析速度快、可信度高、适合样品初级筛选检测等优点，许多学者研究纷纷研究农药、兽药和抗生素等小分子的免疫传感器检测方法，具有灵敏度高、检测费用低、灵活快捷等优点，其关键技术是抗体固定，即把抗体固定在电极上制备高灵敏的电化学免疫传感元件。

发明内容

甲硝唑、替硝唑、地美硝唑、洛硝哒唑、异丙硝唑等都具有相类似的咪唑结构(1、2、3位上取代基不同)，本发明针以甲硝唑的醇基为连接臂，合作半抗原和免疫原、包被原，制备抗体，同时发挥纳米材料表面积大的优势，制备免疫金，且与备金-巯基丙酸单分子膜联接，制备一种高灵敏的硝基咪唑类药物残留电化学传感元件，为抗生类药物残留的快速检测和现场检测提供支撑。

本发明采用如下技术方案：

本发明的基于免疫金的电化学传感元件的制备方法的具体步骤如下：

(1)用0.1mol/L NaOH和0.1mol/L HNO₃分别淋洗金电极三次，每次1min，再置于新鲜配制的piranha溶液，浸泡30min；

(2)取出金电极，超纯水淋洗1min，置于超纯水中超声清洗3min，无水乙醇中超声清洗3min，重复3次；

(3)依次用0.3μm和0.05μmAl₂O₃粉末抛光至呈镜面后，金电极置于piranha溶液，浸泡30min，重复步骤(2)，然后用高纯氮吹干金电极表面；

(4)把金电极浸于三巯基丙酸溶液中温育12h，依次用超纯水、无水乙醇淋洗三次，每次1min，然后用高纯氮吹干金电极表面，即为MPA/金电极，然后将金电极浸于碳二亚胺盐酸盐溶液和N-羟基硫代琥珀亚胺溶液的混合液中12h后，用超纯水淋洗3min，再将金电极浸于含有免疫金的磷酸缓冲液中，4℃过夜，最后用超纯水清洗，高纯氮吹干金电极表面，即为免疫金/MPA/金电极。

步骤(1)和步骤(3)中，所述的piranha溶液是由30wt％的H₂O₂和浓硫酸组成，两者的体积比为1:3。

步骤(4)中，所述的三巯基丙酸溶液的浓度为0.1mol/L。

步骤(4)中，所述的碳二亚胺盐酸盐溶液和N-羟基硫代琥珀亚胺溶液的浓度均为0.1mol/L，混合液中两者的体积比为1:1。

步骤(4)中，所述的磷酸缓冲液的pH为7.4。

步骤(4)中，所述的免疫金的制备方法如下：

(a)胶体金的制备

将所用器皿用酸液浸泡72h，取出，自来水冲洗，蒸馏水浸泡24h,干燥，用含5wt％的二氯二甲基硅烷的三氯甲烷溶液进行硅化，硅化完成后用双蒸水冲洗，烘干，取质量浓度0.01％氯金酸水溶液100mL加热至沸，300rpm搅拌下加入预热的质量浓度1％柠檬酸三钠水溶液4mL，金黄色的氯金酸水溶液在2min内变为灰色，然后由灰色变为酒红色，继续搅拌煮沸，直至溶液呈透亮的红色，冷却后用双蒸水定容至100mL，4℃冰箱中避光保存；

(b)免疫金的制备