[发明专利]一种利用热稳定性重组漆酶制备乳清蛋白膜的方法

权利要求书

1.一种乳清蛋白膜，其特征在于该乳清蛋白膜是通过在纯水中加入乳清蛋白、甘油、重组漆酶及阿魏酸得成膜液，成膜液于80-90℃水浴加热15-30min,倒入铺有塑封膜的玻璃培养皿中，50‐55℃干燥36‐48h揭膜所得；其中所述的重组漆酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的乳清蛋白膜，其特征在于所述的重组漆酶的编码基因如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求2所述的乳清蛋白膜，其特征在于所述的重组漆通过如下方法制备：

(1)以死亡谷芽孢杆菌fmb-103基因组DNA为模板，序列为SEQ ID NO.3的上游引物和序列为SEQ ID NO.4的下游引物合成含有SacI和XhoI酶切位点的漆酶基因序列；

(2)将上一步纯化的PCR产物经SacI、XhoI双酶切后插入载体pET-23a的SacI/XhoI酶切位点之间，获得含有漆酶基因的表达质粒pET-23a-fmb-L103；

(3)将含有fmb-L103表达质粒pET-23a-fmb-L103转化大肠杆菌表达宿主菌株BL21(DE3)pLysS，在37℃培养10-11小时后挑取小菌落,接入含有氨苄青霉素的50ml LB液体培养基，70-90rpm 30℃培养过夜,按照1:40的体积比取种子液加入到含有氨苄青霉素的100ml LB液体培养基,35℃180rpm振荡2-3小时至OD600约为0.6时加IPTG(终浓度100μg/ml)诱导，5小时后离心收集菌体；

(4)将诱导表达收集到的菌体，用磷酸缓冲液重悬菌体，超声波破碎菌体，4℃，10000×g离心10min，收集上清液作为粗酶液，将处理得到的粗酶液按照Ni-NTA His Tag Kit说明书进行纯化得到所述的重组漆酶。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的乳清蛋白膜，其特征在于所述的成膜液中乳清蛋白的质量百分含量为8％-12％，甘油与乳清蛋白质量比例为1:4-1:5，阿魏酸质量百分含量为成膜液质量的1％-1.2％，重组漆酶量为10U/g-20U/g成膜液，成膜液pH为5.5-6，反应温度为85℃，反应时间为20min。

5.根据权利要求4所述的乳清蛋白膜，其特征在于所述的成膜液中乳清蛋白的质量百分含量为10％，甘油与乳清蛋白比例为1:4，阿魏酸质量百分含量为1％，重组漆酶酶量为15U/g，成膜液pH为5。

6.一种制备乳清蛋白膜的方法，其特征在于在纯水中加入乳清蛋白、甘油、重组漆酶及阿魏酸的成膜液，成膜液于80-90℃水浴加热15-25min,倒入铺有塑封膜的玻璃培养皿中，50‐55℃干燥36‐48h揭膜；其中所述的重组漆酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

7.根据权利要求6制备乳清蛋白膜的方法，其特征在于所述的重组漆通过如下方法制备：

(1)以死亡谷芽孢杆菌fmb-103基因组DNA为模板，序列为SEQ ID NO.3的上游引物和序列为SEQ ID NO.4的下游引物合成含有SacI和XhoI酶切位点的漆酶基因序列；

(2)将上一步纯化的PCR产物经SacI、XhoI双酶切后插入载体pET-23a的SacI/XhoI酶切位点之间，获得含有漆酶基因的表达质粒pET-23a-fmb-L103；

(3)将含有fmb-L103表达质粒pET-23a-fmb-L103转化大肠杆菌表达宿主菌株BL21(DE3)pLysS，在37℃培养10-11小时后挑取小菌落,接入含有氨苄青霉素的50ml LB液体培养基，70-90rpm 30℃培养过夜,按照1:40的体积比取种子液加入到含有氨苄青霉素的100ml LB液体培养基,35℃180rpm振荡2-3小时至OD600约为0.6时加IPTG(终浓度100μg/ml)诱导，5小时后离心收集菌体；

(4)将诱导表达收集到的菌体，用磷酸缓冲液重悬菌体，超声波破碎菌体，4℃，10000×g离心10min，收集上清液作为粗酶液，将处理得到的粗酶液按照Ni-NTA His Tag Kit说明书进行纯化得到所述的重组漆酶。