[发明专利]一种利用热稳定性重组漆酶制备乳清蛋白膜的方法

说明书

技术领域

本发明属于食品工业生物技术领域，涉及一种利用热稳定性重组漆酶制备乳清蛋白膜的方法。

背景技术

塑料制品自产生以来给社会带来巨大方便的同时，它也给人类生存环境带来极大威胁。这种用高分子化学聚合材料制成的包装不仅难以降解，还会因燃烧产生污染气体。随着人们对环保意识的增强，采用天然绿色材料来制备可食用的包装膜成为许多研究者的焦点。可食性包装材料是以天然可食性物质，如蛋白质、多糖(淀粉、纤维素)等为原料，通过分子间相互交联作用形成的具有多孔网状的结构，可食用、易降解，并具有一定包装保护功能。

但是目前可食用包装膜应用并不广泛，无法取代塑料的使用，究其原因，主要是制备的可食用膜性能无法同化学聚合物塑料相比，例如拉伸强度、透光性、吸水度、可塑性、软产品(包装膜)多硬产品(包装盒)少；另外成本问题也是制约其发展的一个因素。造成上述两方面的问题的原因正是可食性包装材料的核心问题之一是仍未寻找到良好的起到分子间相互交联作用的交联剂。目前早期在有关交联剂、增塑剂的研究方面以无机试剂为主，如氨水、CMC-Na、聚醇环氧氯丙烷、二元羧酸、NaH₂PO₄等。上述研究结果，虽然在一定程度上提高了食品包装材料的性能，但是仍不能与化学材料媲美。另外，所采用的无机试剂交联剂也给“绿色”蒙上了阴影。酶制剂作为一种纯天然生物制品，具有催化效率高的本质，其本身就是蛋白质，经食品加工后，变性为无毒无害的食品组分，酶制剂是标准的绿色食品添加剂。因此，利用酶催化蛋白、多糖的交联作用，以酶制剂作为可食性包装材料的交联剂将是必然趋势。

我们前期利用重组脂肪氧合酶(LOX)制备了乳清蛋白膜，其性能优于未经LOX处理的对照膜。有研究报道通过高温加热的物理处理方法(80-90℃，处理20-30分钟)，可提高以蛋白质为基质的膜的性能。其机理是加热处理使得蛋白充分变性，降低温度后蛋白质分子的多肽链之间重新形成新的共价键，进而强化了蛋白质分子内及分子间的交联作用。然而，我们前期使用的重组LOX在高温条件下迅速失活(50℃半衰期5-7分钟)。因此在制备膜的过程中，加入重组LOX，在20-25℃下反应2-3h后铺膜，50-55℃干燥36-48h后揭膜。目前为止，在乳清蛋白质加热变性过程中，加入热稳定性的酶，提高膜性能的研究还未见报道。

漆酶(Laccase，EC1.10.3.2，Lac)，是自然界普遍存在的一种含铜金属酶类，可催化各种酚类物质如儿茶酸、单宁、黄酮等氧化为醌，是目前研究发现的对蛋白质、多糖有交联作用的主要酶制剂之一。Lac可以催化蛋白质发生交联聚合，可能是由于Lac能催化蛋白质分子中的酪氨酸残基以及与蛋白质通过非肽键相连的酚类化合物的氧化来实现。另外，可使酚类化合物氧化成醌，而醌类化合物也可与蛋白质的氨基、巯基、吲哚基等基团发生反应从而导致蛋白聚合。大量关于漆酶的研究工作取材于真菌，分泌漆酶的真菌主要集中于担子菌门(Basidiomycota)、子囊菌门(Ascomycota)及半知菌类(Imperfect fungi)等真菌，其中最主要的是担子菌门中的白腐真菌。真菌漆酶最大的问题是其热稳定性差，不适合于实际的生产加工应用。细菌来源漆酶具有良好热稳定性，在蛋白质交联过程中与加热物理变性可以起到协同作用，促进交联反应的进行。而目前关于热稳定性的重组漆酶应用于可食性包装膜的制备还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述，提供一种乳清蛋白膜的制备方法。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种乳清蛋白膜，该乳清蛋白膜是通过在纯水中加入乳清蛋白、甘油、重组漆酶及阿魏酸得成膜液，成膜液于80-90℃水浴加热15-30min,倒入铺有塑封膜的玻璃培养皿中，50‐55℃干燥36‐48h揭膜所得；其中所述的重组漆酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的重组漆酶的编码基因优选如SEQ ID NO.1所示。

所述的重组漆进一步优选通过如下方法制备：

(1)以死亡谷芽孢杆菌fmb-103基因组DNA为模板，序列为SEQ ID NO.3的上游引物和序列为SEQ ID NO.4的下游引物合成含有SacI和XhoI酶切位点的漆酶基因序列；

(2)将上一步纯化的PCR产物经SacI、XhoI双酶切后插入载体pET-23a的SacI/XhoI酶切位点之间，获得含有漆酶基因的表达质粒pET-23a-fmb-L103；