[发明专利]一种金属离子固定化亲和磁球的制备方法及应用

说明书

【技术领域】

本发明涉及亲和磁球技术领域，具体地说，是一种金属离子固定化亲和磁球的制备方法及应用。

【背景技术】

1975年，Porath等利用亚氨基乙二酸(IDA)作为配体固定在以琼脂糖为基质的填料上利用IDA与过渡金属铜、镍、钴或锌离子的螯合作用，发展了一种IMAC(Immobilized Metal-ion affinity chromatography)方法，对表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白进行吸附纯化。这种利用螯合金属与特殊蛋白相互作用而对蛋白进行富集纯化的方法称为固定金属离子亲和色谱(IMAC)。

固定金属离子亲和色谱法对蛋白的富集能力的强弱与基体，配体和金属离子的种类有着重要的关系，配体中与金属离子作用位点及和特异性蛋白的结合能力直接影响着多肽或蛋白的富集效果。常用的基质有大孔硅胶，交联琼脂糖和交联葡聚糖以及有机聚合物TSK-gel G500PW。硅胶载体刚性好，分离效率高，但在高pH下易溶解，低pH下易产生硅羟基。TSK的机械强度介于硅胶和琼脂糖或葡聚糖之间，但与金属螯合配体结合不牢固，使用时金属离子易泄露。配体的作用是将金属离子固定在基质上，为此配体既含能与基质共价键合的活性基团如-N、-OH、-Cl等，又有能与金属离子配位的多个配位原子。常用的配体主要是亚氨基二乙酸，氮基三乙酸，N，N，N′-三(羧甲基)乙烯二胺等。固定金属离子通常为具有d层空价电子轨道的过渡金属如Cu²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺等，它们与配体形成可与蛋白质结合的金属螯合配体。

【发明内容】

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种以磁性无机物四氧化三铁为核，双层有机聚合物包裹的核-壳-壳结构的核壳材料，以及将其应用于对特异性多肽或蛋白进行富集检测的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种金属离子固定化亲和磁球的制备方法，其特征在于，其具体步骤为：

第一、2.0～3.0g的三氯化铁和90～110mL的乙二醇和7.0～7.5g的无水乙酸钠进行均匀混合，在150～250℃进行高温水解反应，得到四氧化三铁磁球；

第二、将200～250mg四氧化三铁磁球分散在体积比为1∶4～1∶6的乙醇和水的混合溶液中，逐滴加入0.3～0.5mL的3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯机械搅拌1～2天，得到聚合物包裹的磁球；

第三、将步骤二中得的聚合物包裹的磁球分散在40～50mL的乙腈中，加入200μL的烯丙基氯单体和300～350μL二甲基丙烯酸乙二醇酯的交联剂及10～15mg偶氮二异丁腈引发剂于90～100℃进行回流反应，得到以具有以四氧化三铁为核，双层有机聚合物包裹的核-壳-壳结构的磁球；

第四、将步骤三中得的双层有机聚合物包裹的核-壳-壳结构的磁球分散在40～50mL的1∶1～1∶5的三氯甲烷与三乙胺的混合溶液中，加入200～300mg的亚氨基乙二酸于70～90℃进行回流反应，得到以亚氨基乙二酸进行结构修饰的磁球；

第五、将步骤四中得到的亚氨基乙二酸进行结构修饰的磁球加入含有0.05～2mol/L的可溶性铜、镍、钛及其他重金属离子的溶液中，用氢氧化钠溶液将溶液pH值调整为6～9，在室温下实现金属离子的固定化，得到螯合金属离子的磁性微球。

一种特异性多肽或者蛋白的富集检测方法，其具体步骤为：

(1)将制得的螯合金属离子的磁球用水溶液进行清洗1～3次，去除游离的金属离子；

(2)将步骤(1)清洗后的螯合金属离子的磁球与0.4～0.6mg/L蛋白溶液例如牛血清白蛋白(BSA)和牛血红蛋白(BHb)进行混合1～2h，利用磁分离对含有组氨酸的多肽或者蛋白进行选择性富集和快速分离，实现对高丰度的多肽或蛋白进行去除和低丰度的多肽或蛋白的富集；

(3)将步骤(2)中吸附多肽或蛋白的磁球用0.2～0.4g/mL的咪唑溶液进行洗脱，用于检测或其他应用目的；

(4)可以利用紫外光谱进行检测，并计算磁球对特异性多肽或蛋白的吸附容量。

与现有技术相比，本发明的积极效果是：