[发明专利]具有减少的细胞摄取的因子VIII变体

说明书

本申请是2011 年9 月14 日提交的题为“具有减少的细胞摄取的因子VIII 变体”的国际申请号为PCT/EP2011/065913 发明专利申请的分案申请，

原申请进入中国国家阶段获得的国家申请号为201180054958.3。

发明领域

本发明涉及修饰的凝血因子。本发明更具体地涉及具有减少的细胞摄取的修饰凝血因子，其导致清除率降低/细胞摄取减少和/或免疫原性降低。本发明另外涉及这样的分子的用途以及用于产生这样的分子的方法。

发明背景

A型血友病是由凝血因子VIII (FVIII)活性缺乏或功能异常引起的遗传性出血性疾病。因为通常发生初始血凝块的形成，所以临床表现不是基于初级止血。而是由于缺乏次级凝血酶形成和初级凝块的血纤蛋白稳定化，凝块不稳定。通过静脉内注射分离自血液或重组产生的FVIII治疗该病。FVIII给予后在大约20-40%的重度A型血友病患者中发生针对FVIII的中和抗体(抑制剂)的形成，致使用FVIII的进一步治疗无效。对抑制剂的诱导因此在血友病保健中提供主要难题。

当前的治疗推荐正从传统应要求治疗转向预防。与von Willebrand因子(vWF)结合的内源性FVIII的循环半寿期是12-14小时，因此将进行一周数次的预防治疗以便让患者获得实际上无症状的生活。对于许多人，尤其是儿童和少年，静脉内给药与显著不便和/或疼痛联系在一起。

在开发具有显著延长的循环半寿期的FVIII变体中已使用多种方法。多种这些方法涉及FVIII与亲水聚合物例如PEG (聚乙二醇)的缀合。WO03031464公开了其中PEG基团可与多肽上存在的聚糖连接的酶促方法。

亦有人建议，调节低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)介导的FVIII清除以便获得具有减少的细胞摄取/清除率的FVIII变体，并因此增加体内循环半寿期，但该方法受FVIII表面上存在的潜在LRP结合位点的显著大量冗余和这些位点作用的不确定性所限制。此外，这些位点中一些紧密靠近对FVIII:C活性关键的区域，降低的LRP结合可伴随活性的实质性损失，其使得FVIII变体作为治疗剂是较不吸引人的。认为LRP和相关受体与其配体的相互作用涉及配体表面上的赖氨酸残基在受体的酸性“项链(necklace)”中对接(Mol Cell 2006; 22: 277-283)。此外有人表明，疏水残基与赖氨酸残基一起可涉及与LRP家族成员的相互作用(FEBS J 2006; 273: 5143-5159, J Mol Biol 2006;362: 700-716)，并可因此推测，是否除了关键赖氨酸残基或其他带正电荷残基外的这些疏水残基的修饰可导致与LRP家族成员的相互作用减少和潜在延长和/或减少的清除。

为了具有治疗吸引力，FVIII变体应该保留FVIII促凝血功能。由此可见，本领域需要具有维持的FVIII活性以及显著延长的体内循环半寿期和/或降低的免疫原性的特定FVIII变体。

发明概述

本发明因此涉及具有FVIII活性的重组FVIII变体，其中所述变体包含命名为“C1足”和/或“C2足”的FVIII C1和/或C2结构域的2、3、4、5、6、7、8、9或10个表面可接近的带正电荷残基的取代，其中所述表面可接近的带正电荷氨基酸残基(例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸残基)被但不限于丙氨酸或谷氨酰胺取代，和其中取代导致细胞摄取减少。本发明另外涉及重组FVIII变体，其中所述FVIII变体包含K2092A取代和F2093A取代，其中所述变体与半寿期延长部分例如PEG缀合。本发明亦涉及具有FVIII活性的重组FVIII变体，其中所述变体包含引起额外的糖基化位点的突变，其中所述糖基化位点的聚糖赋予降低的与KM33抗体结合的能力。

本发明的FVIII变体具有与增加的循环半寿期相关的减少的细胞摄取。本发明的FVIII变体可另外有具有减少的LRP结合的优势。本发明的FVIII变体与无该突变类型的FVIII分子相比可另外有具有降低的免疫原性的优势。关于降低的免疫原性的解释可为，带正电荷的残基在FVIII的C1和/或C2足被取代，导致负责呈递FVIII至免疫系统的细胞摄取减少。

附图简述