[发明专利]一种全细胞催化合成香草醛的方法

说明书

本发明公开一种全细胞催化合成香草醛的方法，本发明的反应体系中，通过添加离子溶剂或无机氮源，使得香草醛的产率得到大幅提升，同时通过选用高特异性的菌株CGMCC1347，其高特异性地转化异丁香酚生成香草醛，减少了副产物的生成，降低了后期分离纯化的成本。

技术领域

本发明涉及香料领域，尤其涉及一种全细胞催化合成香草醛的方法。

背景技术

香草醛（4-羟基3-甲氧基-苯甲醛），俗称香兰素、香草素、香兰醛、香茅醛，是全球最重要的香味物质之一，具有浓郁的香子兰花的气味，素有“香料皇后”的美誉。其以游离态和葡萄糖苷的形式广泛存在于自然植物中，如香荚兰豆、丁香油、天门冬、甜菜根、安息香、苏合香膏，较集中存在于香荚兰的豆荚中（含量1.5%-3%）。由于其特殊的香味及结构特征，被广泛应用于各个领域，其中约60%用作食品、糖果、饮料中的香味物质，约33%用作香料和化妆品中的成分，约7%作为药物中间体。

香草醛每年的需求量在10,000 t以上。目前市场上的香草醛绝大部分来自化学合成，主要以愈创木酚和木质素为合成原料，价格较低，每公斤约13美元。由香荚兰中提取的天然香草醛年产量仅20 t，约占0.2%的份额，价格昂贵，每公斤达4,000美元。而用微生物转化法生产的香草醛与植物提取的天然香草醛等同，被称为生物香草醛，符合EU和FDA对天然香精的食用安全要求，但目前其年产量只有数吨，每公斤价格600~1000美元。

随着人们对健康安全的愈发重视，天然香草醛的需求不断上升。微生物转化法生产香草醛在生产周期上和规模扩大方面要优于植物提取法，生产成本低于植物提取法，而产品品质优于化学合成的香草醛，且无污染、对环境友好，是一种极有前景的制备方法，因此越来越受到青睐。

但是现有技术中，微生物转化法制备香草醛仍然存在许多不足：

1、容易生成副产物，产率低。因为微生物本身是一个多酶体系，把它直接加入到反应中，微生物里的某些酶可能与目的酶竞争相同的底物，导致底物利用率下降、副产物的生成、产率低。再者，香草醛生成后也会被微生物中的酶进一步代谢为香草酸或其他代谢产物；

2. 底物在水溶液中的溶解度很低，并且底物会对微生物的生长或酶的活性有抑制作用；

3. 产物香草醛及其他副产物也会对微生物的生长或酶的活性有抑制作用。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种全细胞催化合成香草醛的方法，旨在解决现有技术中香草醛微生物转化合成产量低、容易生成副产物等问题。

本发明的技术方案如下：

一种全细胞催化合成香草醛的方法，其中，包括步骤：

S1、将保存的菌株CGMCC1347接入种子培养基中活化，32~40℃、100~300rpm振荡反应6~36h得到种子液；

S2、反应结束后，取2ml种子液接入30~70ml发酵培养基中，32~40℃、100~300rpm振荡反应12~36h得到菌液；

S3、取10ml菌液3000~6000rpm离心5~20min，弃上清，获得湿菌体；

S4、往湿菌体中加入5~15ml缓冲溶液，重悬菌体并转移至装有0.1~0.5g异丁香酚的锥形瓶中，盖上橡胶塞，25~35℃、100~300rpm振荡反应48~96h；

S5、反应结束后，加入5~15ml95%乙醇以终止反应，沉淀蛋白并溶解底物和产物，充分混匀后5000~8000rpm离心10min；

S6、取离心后的上清液，用乙醇稀释，过滤后得到香草醛。