[发明专利]一种三维复合细胞聚集体模型及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种三维复合细胞聚集体模型，其特征在于：是内部含有微球的干细胞聚集体，由所述微球表面固定化基因工程钙黏素蛋白家族的融合蛋白分子，该融合蛋白分子与干细胞通过干细胞自有的钙黏素粘附因子进行构建，进而使所述微球与干细胞通过促聚集三维共培养而获得的，具体方法为：

(1)使用天然或化学合成聚合物制备缓慢释放生长因子的亚微米级微球，所述聚合物的粒径范围在15±5μm；

(2)将经过真核细胞蛋白表达体系表达并纯化的hE-cad-Fc融合蛋白稀释，浸泡微球，在4℃至37℃，孵育0.5-24小时；

(3)弃上清，用PBS淋洗1-3遍，除去未稳定固定的融合蛋白hE-cad-Fc，获得hE-cad-Fc基质化的微球；

(4)将干细胞与上述hE-cad-Fc基质化微球混匀，通过悬滴法、离心法培养技术促进微球与干细胞形成三维含材料微球的多细胞聚集体。

2.根据权利要求1所述的三维复合细胞聚集体模型，其特征在于：所述步骤(4)中离心法培养技术为采用Stem Cell Aggrewell^TM进行培养，1000rpm离心5min后静置培养16h。

3.根据权利要求1所述的三维复合细胞聚集体模型，其特征在于：所述聚合物为天然聚合物，包括胶原、明胶、海藻酸、壳聚糖、透明质酸；或为化学合成聚合物，包括聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-羟基乙酸、聚乙二醇或聚苯乙烯。

4.根据权利要求1所述的三维复合细胞聚集体模型，其特征在于：所述干细胞为胚胎干细胞或间充质干细胞。

5.根据权利要求1所述的三维复合细胞聚集体模型，其特征在于：所述融合蛋白分子是利用基因工程技术将E-钙黏素蛋白胞外域和免疫球蛋白Fc结构域基因重组，构建含有E-钙黏素蛋白和Fc双功能融合蛋白基因序列，经基因转染、表达及分离纯化而制得，所述融合蛋白分子通过Fc介导固定于微球表面。

6.根据权利要求1所述的三维复合细胞聚集体模型，其特征在于：所述融合蛋白分子hE-cad-Fc的碱基序列为序列1所述序列。

7.权利要求1-6之一所述三维复合细胞聚集体模型的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：

(1)使用天然或化学合成聚合物制备缓慢释放生长因子的亚微米级微球，所述聚合物的粒径范围在15±5μm；

(2)将经过真核细胞蛋白表达体系表达并纯化的hE-cad-Fc融合蛋白稀释，浸泡微球，在4℃至37℃，孵育0.5-24小时；

(3)弃上清，用PBS淋洗1-3遍，除去未稳定固定的融合蛋白hE-cad-Fc，获得hE-cad-Fc基质化的微球；

(4)将干细胞与上述hE-cad-Fc基质化微球混匀，通过悬滴法、离心法方法诱导干细胞形成三维聚集体。

8.根据权利要求7所述的三维复合细胞聚集体模型的制备方法，其特征在于：所述hE-cad-Fc融合蛋白使用浓度为0.1-20μg/ml。

9.根据权利要求7所述的三维复合细胞聚集体模型的制备方法，其特征在于：所述细胞与hE-cad-Fc基质化微球混合比例为1:1-10:1。

10.权利要求1-6之一所述三维复合细胞聚集体模型的应用，其特征在于：能够用于提高材料的干细胞黏附、增殖以及批量扩增及经时、定向调控诱导干细胞分化、及分化细胞功能的表达和维持。