[发明专利]一种三维复合细胞聚集体模型及其制备方法与应用

说明书

本发明提供了一种三维复合细胞聚集体模型及其制备方法与应用，该模型以天然或化学合成聚合物为基质材料，制备亚微米级微球，内部包埋或表面固定细胞因子，与细胞共培养，形成含有微球的复合细胞聚集体，实现由内而外调控聚集体内细胞生物学活性。该模型可用于干细胞三维状态下增殖、分化的研究，克服了传统干细胞三维培养时由于培养基中液性因子传质不均、作用时间短而导致的细胞聚集体组成/结构非均质、细胞增殖效率低及定向诱导分化效率低的问题，可在三维立体仿生条件下模拟细胞‑细胞、细胞‑细胞外基质以及细胞‑可溶性因子间的相互作用，为体外构建和优化干细胞培养技术，以及组织工程化构建各类组织器官类似物或等同物提供理论和技术支持。

技术领域

本发明涉及细胞体外培养技术领域，尤其是一种三维复合细胞聚集体模型及其制备方法与应用。

背景技术

在体内，细胞处于一个高度信息化的微环境中，其中包括各种时间/空间动态变化的物理化学信号，细胞受各种信号刺激调控，以实现其特定的生物学功能。这种细胞与微环境间的相互作用包括来自周围细胞、细胞外基质和可溶性因子的各种复杂的生物化学、生物力学和生物电学等信号刺激响应。其中，细胞与细胞之间是通过直接接触或旁分泌可溶性因子而发生相互作用。这种细胞间的通讯作用是维持细胞、组织及器官结构与功能的重要环节，同时也是调节体内外组织修复与重建的关键因素。如何有效模拟体内微环境、调控细胞与外界微环境间的相互作用，对于细胞形态与功能的维持以及体外组织的仿生重建至关重要。细胞三维培养(three-dimensional cell culture,TDCC)是指将具有三维结构的材料载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养，使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长,构成三维的细胞-载体复合物。该培养方式中通过载体材料的设计与制备，既能最大程度的模拟体内环境使细胞功能稳定表达，又能展现细胞培养的直观性及条件可控性的优势，是目前体内外组织结构及其功能重建的最常用手段之一。

近年来，利用干细胞体外三维扩增及诱导分化的方法，进行体内组织修复的策略已成为生命科学、再生医学等领域的研究热点。其中，胚胎干细胞(ESCs)由于其具有在体内、外向多种类型组织细胞分化的潜能，具有广阔的应用前景。间充质干细胞(MSCs)是干细胞家族的重要成员，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，且在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，能够作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。

胚胎干细胞的分化应首先在无血清的培养基中诱导其聚集形成细胞聚集体，即拟胚体(EB)，此后模仿体内胚胎发生的条件，依次改变拟胚体的生长环境，诱导其分化出特定细胞。而现有的MSCs的扩增及诱导分化方法主要为二维平板培养。由于在三维培养体系中细胞的生长方式更接近体内，能够更为真实的模拟复杂的体内细胞微环境，促进干细胞体外诱导分化，有学者采用模拟胚胎干细胞拟胚体(EB)的形态结构制备间充质干细胞聚集体，发现该培养方式能够提高间充质干细胞中细胞因子的分泌，还能显著提高细胞诱导分化效率。但是，目前以上二者的培养及定向诱导分化过程中均存在有长期培养细胞活性降低，诱导分化效率较低，诱导效果不稳定，以及体内诱导效果不确切等问题亟待解决，限制其进一步向临床应用转化。

借助工程学、材料学等相关学科的发展，采取在细胞聚集体中加入微球的方式，有望改善聚集体内部的结构，进而提高三维细胞聚集体中细胞活性和定向诱导分化效率。但目前学者采用的微球材质主要为常见的天然细胞外基质或合成化学材料，并没有脱离传统细胞培养中基于整合素家族信号分子改善材料与细胞相互作用的设计思路。