[发明专利]抗p16单克隆抗体及其制备方法和应用

说明书

发明公开了一种抗p16单克隆抗体，抗p16单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列由SEQ ID No.2所示的DNA序列所编码，抗p16单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列由SEQ ID No.3所示的DNA序列所编码；所述抗p16单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.4所示的氨基酸序列，所述p16单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.5所示的氨基酸序列。本发明获得的杂交瘤(30859‑S17)分泌产生的单克隆抗体，能识别重组蛋白p16分子和表达p16的淋巴细胞，能够检测高表达p16蛋白的皮肤鳞状细胞癌、胰腺癌、黑素瘤、淋巴瘤、食管癌、宫颈癌等多种肿瘤组织。

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种可以识别人p16蛋白质分子的单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

p16分子定位于细胞核及细胞质，能特异性的结合细胞分裂周期(Cell DivisionCycle)关键酶CDK4或CDK4与细胞周期素(Cyclin)的复合体，参与G1-S转换的调控，抑制CDK4的活性，阻止细胞进入S期，对RB基因控制的细胞增殖周期中起负调节作用。一旦p16基因缺失、突变等导致功能缺失，则不能抑制CDK4，最终导致细胞进入恶性增殖，加速肿瘤发生。因为p16通过与cyclin D竞争结合CDK4、CDK6抑制cyclin D/CDK4的活性，当去除p16的抑制作用后，将使细胞异常增殖，过度激活周期蛋白和/或抑制蛋白的失活，都会导致CDKs的过度作用，导致细胞非正常增生。而一旦p16失活，则会引起细胞恶性增殖。细胞中，p16蛋白的表达通常受到另两种抑癌蛋白：p53和RB的调控，处于低水平状态。

研究表明，p16异常表达可用于各种肿瘤的研究，如卵巢癌(袁碧波，张士伟，孙保存，刘容珍，卵巢肿瘤p16蛋白的表达及意义，中国肿瘤临床，2000，4(27)：265-267)、肺腺癌(陆金友，汤一珍，刘丽华，孟刚，肺腺癌组织p16蛋白表达与其预后的关系，安徽医科大学学报，1999,6(34)：452-454)、直肠癌(张远,王小强,王金柱,白旭升，直肠癌p16蛋白表达的检测及其意义，陕西肿瘤医学，2001,6(9):105-107)、乳腺癌(崔素萍，王花丽，彭伟，刘海静，侯琳，张波，乳腺癌组织p16异常表达的相关分析，北京大学学报，2012,5(44)：755-759)。目前研究表明p16在高级别宫颈上皮内肿瘤和高危型HPV感染的肿瘤中高表达(齐朝阳，陈艳，曾鸿，高宇琳，郭红梅，宫颈上皮内肿瘤p16、p53、Ki67、p63的表达与HPV感染及其临床意义，实用医学杂志，2011,27(20):3639-3640)。p16蛋白分子量为16kDa左右，选择不同的抗原进行免疫，制备出不同结合特性的抗体，对表达抗原细胞具有不同的识别能力和模式。鉴于p16分子在肿瘤病理研究中的重要性，已有不同的抗体制备用于不同免疫学方法。

公开号为CN 101446591A的发明专利“p16^INK4a双抗体夹心酶联免疫吸附检测试剂盒”，用p16^INK4a多克隆抗体包被酶标板、生物素标记的p16^INK4a单克隆抗体进行宫颈癌筛查。公开号为CN1201210197293的发明专利“一种检测肿瘤标志物p16抗原表位氨基酸序列及应用”也提供了一种肿瘤抑癌基因p16的抗原氨基酸序列，应用该多肽抗原能检测肺癌的食管癌患者血中相应的特异性抗原表位。该抗原多肽及其抗体可用于制备肿瘤早期诊断试剂，开发肿瘤的靶向药物。目前在肿瘤诊断中使用最多的p16抗体为克隆号E6H4抗体。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种可被广泛应用、可准确诊断各种肿瘤类型的抗p16单克隆抗体。

本发明的技术手段为：