[发明专利]一种肺炎链球菌的荚膜染色方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物检测领域，尤其涉及一种肺炎链球菌的荚膜染色方法。

背景技术

荚膜是细菌在一定条件下分泌的粘液或胶态物质，通常是由多糖类、多肽类或多糖蛋白复合体组成，不同的细菌其荚膜成分也有一定差异。肺炎链球菌荚膜主要是由多糖组成，根据荚膜成分的不同可以分为90多个血清型(丁绍卿，叶人邦，袁曾麟.肺炎链球菌血清学分型的研究.生物制品学杂志.1988,1(1):18-22)，且不同型别的血清型荚膜厚度有所不同。荚膜作为细菌的一种特殊结构，荚膜的低折光性与亲和染料能力差等特性，使其不易着色，制作一张好的荚膜染色玻片需要正确的染色方法和一定的熟练程度。

传统的细菌荚膜染色方法有赫氏(Hiss)染色法、墨汁染色法、Tyler染色法等。凌体淑等人在之前的基础上创建了新的细菌荚膜染色法(凌体淑，叶迎春，赵世鸿，等.细菌荚膜染色的创新.现代医学检验杂志.2004，19(4):35-36)。郭淑清等人以肺炎链球菌为例对荚膜染色方法进行了改良(郭淑清，徐晓莉.荚膜染色法的改良.山西医科大学学报.2001，32(3)：276)。现有的荚膜染色法操作过程如下：

1.赫氏(Hiss)染色法：

将荚膜菌涂片，在空气中自然干燥，不需加热固定。滴加结晶紫染色液，在火焰上微微加热，使玻片上染液冒蒸汽为止，不要水洗，再用200g/L硫酸铜水溶液冲洗染液，切勿用流水冲洗。用吸水纸吸干后油镜观察。

观察结果，菌体及背景呈紫色，荚膜呈淡紫色或无色。

2.墨汁染色法：

在载玻片上滴1滴印度墨水或黑色素水溶液，接种环取菌液一环，与染色液混合均匀，取另一块干净的载玻片将混合物自载玻片一侧平挂至另一侧，又平挂回来，使形成一薄层，在空气中干燥。用吸水纸吸干后油镜观察。

观察结果：菌体及背景呈黑色，荚膜无色。

3.Tyler法：

按常规法涂片，在空气中自然干燥。用Tyler染色液染5-7min，用20％CuSO₄水溶液洗去结晶紫；用吸水纸吸干，并立即加1-2滴香柏油于涂片处，以防止CuSO₄结晶的形成；先用低倍镜再用高倍镜观察。

结果：背景蓝紫色，菌体紫色，荚膜无色或浅紫色。

4.改良荚膜染色法：(凌体淑，叶迎春，赵世鸿，等.细菌荚膜染色的创新.现代医学检

验杂志.2004,19(4):35-36)

①菌涂片的制备：将肺炎链球菌接种于血清肉汤培养基，注射于小白鼠腹腔内，在小白鼠腹腔内注射荚膜保护液，抽出腹腔液，再注射到另外的健康小白鼠腹腔内，然后取腹腔液涂片。

②荚膜染色:将上述涂片在空气中自然干燥、固定，用5g/dl石碳酸复红染色3m in(染液提前30m in放37℃水浴箱预热)，用水冲去染液，倾去玻片上余水，再用特殊媒染剂染3min，水冲洗，最后用1.48g/dl美蓝酒精饱和溶液染0.5m in，水冲洗，干燥后油镜观察。

③结果：肺炎链球菌菌体呈紫红色，荚膜呈浅蓝色，背景无色。

上述方法以及其它的一些方法都存在一定的缺点：首先，操作过程比较复杂，对实验员的操作技能要求较高，容导致实验失败，重复性较差；其次，这些方法染色后能看到清晰荚膜的菌体很少，需要在显微镜下大范围查找，实际操作不方便；再次，由于细菌荚膜含水量高，加热会使菌体失水收缩，与细胞周围染料脱离而产生透明的明亮区，导致假阳性出现。此外，一些改良的荚膜染色方法，对荚膜的形态要求较高，在制备菌片的过程为增强荚膜染色效果，需要添加荚膜保护液，操作繁琐，耗时较长，并且成功率较低，重复性差。

荚膜染色是肺炎链球菌菌种检定中的一项重要检测指标，因此，建立一种快速、简便、染色效果好的荚膜染色方法是非常必要的。

发明内容

为满足上述领域的需求，本发明提供一种针对肺炎链球菌的快速、高效的荚膜染色方法。

本发明请求保护的技术方案如下：

一种用于肺炎链球菌的荚膜染色方法，包括以下步骤：

(1)制备细菌标本；

(2)涂片：取少量所述细菌标本，均匀涂于洁净载玻片上，刮成薄层，自然晾干；

(3)染色：滴加100-150μl的石碳酸复红染液于载玻片上，使之覆盖均匀，自然晾干；

(4)媒染：用水冲洗，自然晾干，滴加媒染剂，均匀覆盖3-5min，用水冲洗，自然晾干；

(5)镜检。

所述石碳酸复红染液为：50mg/ml石碳酸复红溶液。