[发明专利]一种光水解核酶及其制备和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种核酶，该酶利用太阳能催化分解水产生氢气和氧气，以及利用该酶生产氢气和氧气的仪器设备，具体地说是一种光水解核酶及其制备和应用。

背景技术

经典观念，是人类对核酶化学本质认识的飞跃，启发了生物化学家从进化角度思考研究生命起源问题，补充和发展了“中心法则”。核酶（Rz）广泛存在于由低等到高等的多种生物中。

脱氧核酶（DRz）是利用体外分子进化技术获得的一种具有高效催化活性和结构识别能力的单链DNA片段。体外分子进化技术，从一个人工合成的随机多核苷酸单链DNA库中筛选出具有酶活性的DNA分子,称为脱氧核酶.

脱氧核酶的体外筛选Breaker等［1］根据SELEX技术的原理建立了以PCR为基础的体外“催化洗脱”筛选系统。首先合成一个随机的多核苷酸单链DNA库，随机库的两端为固定序列，中间为50-100个随机核苷酸。以此随机单链库为模板，用一个RNA-DNA杂合分子作为引物，在逆转录酶的催化下，将单链库转变为双链库，此双链库就引入了RNA 靶序列，RNA的引入是一个关键步骤，这样就把潜在的催化型 DNA与RNA分子连在一起，从而进行以分子内切割为基础的选择反应。RNA 的引入是由一个人工合成的RNA-DNA 杂合分子介导的，这杂合分子的特征是：12-15个核苷酸的 RNA的5’端有一个固定序列，其3’端含有一个互补于模板3’端的序列。另外，这一杂合引物的5’端还含有一个生物素基团，用于以后的亲和柱分离。

接着将双链随机库核酸分子通过链亲和素柱，通过生物素基团结合于链亲和素柱上，经碱变性，洗脱下不含生物素的一条单链 DNA，从而产生了一个固相化的单链随机寡核苷酸库。在一定的温度和pH下，用一定的离子缓冲液洗脱柱子，若有切割反应发生，被切割的分子就被洗脱下来。再经PCR放大和亲和分离，可重新回到与起始库类似的随机库，从而完成了第一轮筛选。经过10多轮筛选即可产生具有催化功能的分子。再对功能分子进行克隆及测序，并由此推测其二级结构。

随着越来越多的脱氧核酶被筛选出，对其功能性质的研究也随之深入，发现脱氧核酶具有RNA切割作用、DNA切割作用、金属螯合作用和过氧化物酶活性、DNA激酶活性以及DNA连接酶活性等多种催化功能。

本发明采用SELEX的体外分子进化技术，从文库筛选到能在太阳光下催化水产生氢气和氧气的核酶。 

发明内容

本发明的目的是提出一种光水解核酶及其制备和应用，使水分解成氢气和氧气的方法及其装置。

为实现上述目的，本发明所述一种光水解核酶，光水解核酶为序列表SEQ ID No.1 中的核酸序列所示。

所述光水解核酶的制备，实现方法如下：

（1）核酶光水解反应体系：在10ml测定溶解氧的溶液中（碘量法：GB7489-87）加入琼脂0.5克，微波加热3分钟；加入100ul水溶解的1 OD的寡核苷酸文库（十的十二次方个分子数）摇匀；将其倒入平铺平皿中，厚度在2mm，待冷却后形成固体核酶光水解反应体系；

（2）反应：将阳性反应平皿放入太阳下光照，阴性反应液放入避光处，反应6小时；

（3）筛选：将阴阳反应体系中蓝点做对比，并挑出阳性体系中的蓝点；

（4）提取蓝点琼脂中的寡核苷酸，并通过聚合酶链式反应（PCR）扩增寡核苷酸为次级文库；

（5）将次级库重复1-4步骤3至12轮，得到富集的次级文库；

（6）将次级库转入质粒中，再转染大肠杆菌，挑取阳性克隆测序即为序列表SEQ ID No.1 中的核酸序列所示的光水解核酶。

本发明所述一种光水解核酶的检测鉴定方法如下：

（1）核酶的制备：将上述光水解核酶的制备步骤（6）中的阳性克隆提取质粒，利用不对称PCR方法制备单链，升温至95度迅速降温至4度，促使单链形成稳定的空间结构和核酶活性；

（2）检测反应体系配制：在10ml测定溶解氧的溶液中（碘量法：GB7489-87）加入琼脂0.5克，微波加热3分钟；加入100ul水溶解的1 OD的核酶，摇匀；将其倒入平铺平皿中，厚度在2mm，待冷却后形成固体核酶光水解检测反应体系；

（3）检测：平行制备两个含待检测的核酶反应检测体系，一个放入太阳下光照，阴性反应液放入避光处，反应6小时；

（4）评定：将阴阳反应体系中蓝点的大小和数量做对比，并对阳性核酶作鉴定。