[发明专利]一种基于COII基因的南亚乳白蚁荧光定量PCR分子检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物物种分子诊断领域，具体的说是一种对南亚乳白蚁荧光定量PCR分子检测鉴定方法，以及在该方法中应用到的检测用探针和引物组合。

背景技术

乳白蚁危害广泛，会造成非常严重的损失。其危害对象主要包括农林作物、城市建筑物、仓储物资、航运铁路、邮政设施、通讯电缆、文物古迹等。在白蚁主要活动的东南亚及我国南部地区，由于白蚁蛀害造成房屋倒塌的事件屡有发生。乳白蚁多数生活在山林，危害树木。乳白蚁因破坏林木使木材的利用率降低，或使木材的使用寿命降低，从而使木材加工业受到直接或间接的损害。危害果树毁坏木质结构的房屋而使古迹、旅游资源、建筑业受到损害，由此造成潜在的经济影响是难以估量的。

在与原木输出国签订有关贸易协议时，应订明木材不得携带乳白蚁，或者在进境木材去皮或熏蒸处理时进行乳白蚁除虫处理。凡发现进境木材未有检疫证书或携带有乳白蚁的，一律进行灭虫处理。使用化学药剂如溴甲烷熏蒸，5％-10％亚砷酸钠、1％-2％氯丹乳剂喷洒，氯丹原油3％-5％+柴油95％-97％混合喷洒，可以有效地灭杀乳白蚁，也可以用灭蚁灵在乳白蚁出没的地方施药，均可达到满意的效果。

南亚乳白蚁学名是Coptotermestravians Haviland，也叫婆罗乳白蚁，已传入澳洲，主要分布在马来西亚、印度、新加坡、印度尼西亚、巴基斯坦、缅甸，该种乳白蚁是南亚各国危害建筑物的主要白蚁种类之一。兵蚁头部深黄色带褐，宽卵形，长明显大于宽，长宽相差0.25～0.32mm；头部被适度和分散的长短不一的刚毛；囟孔两侧各1根毛，前唇基白色，上唇色和头部相同，上唇透明区末端下方有两根长刚毛，上唇中区具一些短毛；后颏的前半部亦有些刚毛；上颚暗褐色带红，基部带黄褐色；腹部背板淡黄色，具一淡色中纵线带从前胸背板走向腹端。前胸背板的周缘和中区各具一些长短不一的刚毛；腹背被浓密的毛。头两侧缘向前狭缩，在触角隆线后面近直，囟小，孔口最大直径0.10～0.11mm。上唇长稍大于宽；侧缘凸，两侧缘渐向前会聚于透明区端。上额近直，顶端稍向内弯；左上颚基部具3～4个小钝齿；右上颚缺钝齿，切边近直或弱凸出。后须长是最宽部的两倍多，后颊最宽区几为最狭区宽的l.5倍。前胸背板前缘凹刻较深；前侧角窄圆形；侧缘弱凸，向后倾斜；后侧角阔圆形；后缘中间凹刻浅。足中等长；后胫长0.80～0.85mm。

分子生物技术在白蚁分类鉴定方面取得很多研究成果。随机扩增多态性技术(Random Amplified Polymorphic DNA,RAPD)由于对DNA模板纯度要求较高，获得的信息量偏少且重复性差，不适合作为白蚁分子鉴定的手段。限制性片段长度多态性分析(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)虽然比较稳定、准确，重复性好，但操作起来非常繁琐，且放射性污染严重，也不宜采用(Alam,et al,2007；徐刘平等,2009)。Husseneder等(2005)应用简单序列重复标记技术(Simple Sequence Repeats,SSR)对美国新奥尔良Armstrong公园的台湾乳白蚁空间和社会组成，以及种群基因结构进行了描述。该技术对整个实验操作过程的准确度和精确度要求非常高，稍许差错就会对最终结果造成很大影响。以上技术手段在白蚁研究中进行了有益的探索，但对于白蚁分子分类鉴定、遗传进化和系统发育的研究，目前仍未取得很好的成果，还需要更深入的探索研究。

现代分子生物技术的迅速发展弥补了传统形态分类技术在白蚁分类上存在的局限和不足，特别是PCR及其相关技术的开发及应用为白蚁的分类提供了新的、强有力的工具和手段。线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)具有严格母性遗传，相对较小的分子质量，世代间不发生重组，遗传标记丰富且易于提纯等特点，被广泛应用于动物分类、起源、系统进化、群体遗传结构等方面的研究(Simon,1994)。而核糖体RNA基因16S rRNA序列由于进化速率较慢，常用于白蚁的种类鉴定(Szalanski,2004)和分子系统发育分析(Scheffrahn,2004；Jenkins,2007)。细胞色素C氧化酶I(cytochrome c oxidase subunit I，COI)和细胞色素C氧化酶II(cytochrome c oxidase subunit II，COII)基因变异较慢，兼具有保守性和变异性的双重特点，在鳞翅目、鞘翅目、双翅目等昆虫鉴定中得到了很好的应用。