[发明专利]一种酶法合成阿魏酸的方法

权利要求书

1.一种酶法合成阿魏酸的方法，将S-腺苷甲硫氨酸SAM上的甲基转移至咖啡酸上，最终形成产物阿魏酸，包括以下步骤:

a)通过大肠杆菌的发酵高效表达川芎咖啡酸-O甲基转移酶(以下均缩写为

COMT)，通过离心收集菌体，用Tris-HCl缓冲液重悬菌体，超声裂解菌体，获得含有川芎COMT的混合酶液；

b)由a)所获川芎COMT将SAM提供的甲基转移至咖啡酸，最后转化成阿魏酸。

2.根据权利要求1所述之酶法合成阿魏酸的方法，其特征在于，所述a)步骤包含如下具体工艺：

A构建生产转化菌株：

1).用分别带有EcoR1和BamH1双酶切位点的引物(A1：CGCGGATCCATGAATACGGAGCTGATCCCACC；A2：CGGAATTCACATTAAGCAGATGCCAGACACCC)从川芎cDNA中通过PCR扩增出川芎COMT基因的全长阅读框；

2).将扩增出来的川芎COMT基因片段和pET28a分别用EcoR1和BamH1双酶切消化，获得两端带有粘性末端的片段；用T4DNA连接酶连接两个片段，体系为10*T4DNA ligase buffer 2.5ul、双酶切后的川芎COMT DNA片段6ul、双酶切后的pET28a载体2ul、T4DNA ligase 1ul,用灭菌的双蒸水补足25ul；16℃连接过夜；获得连接好的重组质粒；

3).取10ul重组质粒转化BL21感受态细胞。将转化成功的重组BL21基因工程菌涂布于含有50mg/L卡那霉素的平板中筛选阳性克隆；

4).将初步筛选出来的重组菌株用菌落PCR和质粒双酶切鉴定后，经测序以确定阅读框的正确，得到预期的重组菌株；

B发酵扩大重组菌株

1).发酵培养基：蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,NaCl 10g/L；溶解后，高温高压灭菌；

2).发酵条件：37℃，200rpm将重组菌株培养至OD600＝0.6；加入IPTG，使其终浓度为1mM/L，17～20℃培养8～10h。

3.根据权利要求1所述之酶法合成阿魏酸的方法，其特征在于，所述b)步骤包含如下具体工艺：

1).将获得的发酵液4℃，5000g离心10min离心收集菌体；

2).用10ml 20mM的Tris-Hcl pH7.9的缓冲液重悬菌体，超声裂解菌体。超声程序为60W，工作9s、暂停6s，冰浴条件下重复199次；4℃，13000g离心去除细胞碎片。收集上清，获得含有川芎COMT的混合酶液；

3)反应体系：500uM的咖啡酸，1mM SAM，100mM MgCl2，1mM DTT，100mM的磷酸钾缓冲液100ml，1-5ml的混合酶液；

4)37℃静置6～8h；加5-10ml浓HCl，终止反应；

5)用乙酸乙酯萃取4次，获得阿魏酸粗提液。