[发明专利]一种酶法合成阿魏酸的方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物工程应用领域，尤其是一种川芎咖啡酸-O甲基转移酶(以下均缩写为COMT)基因在体外异源高效原核表达的重组大肠杆菌的基因工程菌株构建并通过咖啡酸甲基化转化成阿魏酸的酶法转化方法。

背景技术：

阿魏酸是植物界普遍存在的一种酚酸，化学名称为4-羟基-3甲氧基肉桂酸。它有许多保健功能，如清除自由基、抗血栓、抗菌消炎、抑制肿瘤、防治高血压、心脏病、增强精子活力、抑制人表皮黑素细胞增殖、黑素合成及酪氨酸酶活性等，应用于保键化妆品领域。阿魏酸在食品工业中主要用于制备天然香兰索、抗氧化剂、防腐剂、交联剂和机能促进剂等，同时阿魏酸阿魏酸毒性低，易于为人体代谢，在医学上治疗心脑血管疾病，保护肝脏、肾脏，抗炎以及治疗白内障等疾病方面很有价值，应用前景广泛。

目前阿魏酸可通过化学合成法和提取法等四类方法获得。化学合成法多以香兰醛和丙二酸为原料，以无水吡啶为溶剂，哌啶作催化剂，通过缩合反应获得。但是该法反应时间过长、易产生顺反混合体、溶剂用量大，产率低。第二类是采用不同提取方法从不同材料中提取，比如工业上主要采用碱法分解米糠中的γ-谷维素生产高纯度的阿魏酸，但是该法产量低、产生环境污染且成本高，从而制约了阿魏酸大规模的生产及应用。第三类是采用水解法从阿魏酸酯制备阿魏酸、阿魏酸钠；第四类方法是生物合成法，比如用几种微生物(Arthrobacter Blobiformis)将丁香油中提取得到的丁子香酚肉桂酸酯转化为阿魏酸。

发明内容：

鉴于现有技术的以上不足，本发明的目的是提供一种酶法合成阿魏酸的方法，并使其具有工艺简单、反应条件温和、转化效率高、转化成本低等优点。

本发明的目的是通过如下的手段实现的。

一种酶法合成阿魏酸的方法，将S-腺苷甲硫氨酸(SAM)上的甲基转移至咖啡酸上，最终形成产物阿魏酸，包括以下步骤:

a)通过大肠杆菌的发酵高效表达川芎COMT，通过离心收集菌体，用Tris-HCl缓冲液重悬菌体，超声裂解菌体，获得含有川芎COMT酶的混合酶液；

b)由a)所获川芎COMT将SAM提供的甲基转移至咖啡酸，最后转化成阿魏酸。

在实际实施过程中，上述a)步骤包含如下具体工艺：

A构建生产转化菌株：

1).用分别带有EcoR1和BamH1双酶切位点的引物(A1：CGCGGATCCATGAATACGGAGCTGATCCCACC；A2：CGGAATTCACATTAAGCAGATGCCAGACACCC)从川芎cDNA中通过PCR扩增出川芎COMT基因的全长阅读框；

2).将扩增出来的川芎COMT基因片段和pET28a分别用EcoR1和BamH1双酶切消化，获得两端带有粘性末端的片段；用T4DNA连接酶连接两个片段，体系为10*T4DNA ligase buffer 2.5ul、双酶切后的川芎COMT DNA片段6ul、双酶切后的pET28a载体2ul、T4DNA ligase 1ul,用灭菌的双蒸水补足25ul；16℃连接过夜；获得连接好的重组质粒；

3).取10ul重组质粒转化BL21感受态细胞。将转化成功的重组BL21基因工程菌涂布于含有50mg/L卡那霉素的平板中筛选阳性克隆；

4.将初步筛选出来的重组菌株用菌落PCR和质粒双酶切鉴定后，经测序以确定阅读框的正确，得到预期的重组菌株。

B发酵扩大重组菌株

1).发酵培养基：蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,NaCl 10g/L；溶解后，高温高压灭菌；

2).发酵条件：37℃，200rpm将重组菌株培养至OD600＝0.6；加入IPTG，使其终浓度为1mM/L，17～20℃培养8～10h。

在实际实施过程中，上述b)步骤包含如下具体工艺：：

1).将获得的发酵液4℃，5000g离心10min离心收集菌体。

2).用10ml 20mM的Tris-Hcl pH7.9的缓冲液重悬菌体，超声裂解菌体。超声程序为60W，工作9s、暂停6s，冰浴条件下重复199次。4℃，13000g离心去除细胞碎片。收集上清，获得含有川芎COMT的混合酶液。

3)反应体系：500uM的咖啡酸，1mM SAM，100mM MgCl2，1mM DTT，100mM的磷酸钾缓冲液100ml，1-5ml的混合酶液；

4)37℃静置6～8h；加5-10ml浓HCl，终止反应；

5)用乙酸乙酯萃取4次，获得阿魏酸粗提液。