[发明专利]一种癌症早期基因诊断试剂盒及诊断方法

说明书

技术领域

本发明涉及癌症基因诊断和基因治疗领域，尤其涉及一种癌症早期基因诊断试剂盒及诊断方法。

背景技术

现有技术中已经研究出关于癌症发病的原理和病因，癌症发病有以下步骤：1，致病基因突变/扩增；2，其调节基因缺失/失活；3，癌变基因扩增：骨髓等组织干细胞从只有致病基因突变/扩增的癌前干细胞，发展为拥有致病基因和癌变基因双扩增的癌干细胞；4，癌干细胞表面多个生长因子受体与其微环境中多种生长因子间的互动，推动癌干细胞集落向癌瘤发展；5，在转化生长因子及其受体等因素介导下发生癌瘤细胞侵润和转移，并形成新部位的癌瘤。

目前，国内外流行的基因诊断多采用聚合酶链反应(PCR)技术。采用已知基因的一对引物(primers)，以待测生物标本DNA作模板，在特定的反应系统中，经过热变性-退火-延伸，数十个循环后，对反应产物作聚丙烯酰胺电泳分析，观察电泳带型及其强度，判断待测基因扩增与否，及其与疾病的关系。近10几年来，在此基础上作技术改进，发明适时定量PCR仪，克服了普通PCR仪的缺点，并使产物定量化，从而更适合临床使用。

为了彻底战胜癌症，本发明创作者經过长期努力，在创立癌症早期基因治疗技术并应用于临床的同时，开发出癌症早期基因诊断技术和晚期癌特定组合的靶向治疗加基因治疗技术。这些都是前所未有的发明和创造。而非对某项技术的补充。

发明内容

本发明的目的在于提供一种癌症早期基因诊断试剂盒及诊断方法，满足癌症早期基因治疗的需要。

为实现上述目的，本发明提供一种癌症早期基因诊断试剂盒，试剂盒包含致病基因和癌变基因两对PCR引物；

其中，V-erbB PCR引物序列如下：

P1：5‘CAC TGT GTG AAG GCC TGC 3’；

P2：5‘CTT ATA AAT AGT GCC AAA AGC 3’；

TS引物序列根据TS基因编码区随机设计。

本发明还提供一种癌症早期基因诊断试剂盒的诊断方法，采用聚合酶链反应方法，即针对上述两基因设计两对引物，会同其它试剂组合而成基因诊断试剂盒；

步骤a，骨髓细胞模板DNA的提取：用小刀将患者骨髓涂片上的细胞刮下来，收集于1.5ml EP管内，加入TEN(15Mm Tris，15mM EDTA，15mM Nacl，PH8.0)液500ul，10％SDS 75ul，蛋白酶K(2.0mg/ml)10ul，于55℃水浴中孵育5小时；

步骤b，聚合酶链反应条件：模板变性条件为97℃，7分钟，32个循环，每个循环中变性条件为94℃5分钟，退火条件为52℃，1分钟，延伸条件为72℃，2分钟，最后一次循环之后延伸时间为5分钟，取出置于4℃保存。

现将本基因诊断法产生之前的研发过程简述如下：

1，吸收国外有关研究成果即禽类原始红细胞增多症(Avian Erythroblastosis)及其传染性致病病毒(AEV-ES4)基因组所含癌基因V-erbB和V-erbA。正是它们的协同作用导致禽类红白血病的发生。研究证明，V-erbB产物与EGFR-TK，高度同源且EGFR在大多数肿瘤高表达。针对EGFR的单抗和针对TK的小分子抑制剂治疗肿瘤均有效。

2，引进上述病毒癌基因作探针和Southern blot杂交技术，对急性白血病，肿瘤，MDS，特别是家族性白血病和MDS，进行细胞遗传学和一系列分子生物学研究。并最终证明，内源性V-erbB是白血病等癌症共同致病基因。它的缺失或插入等突变并扩增，导致白血病等癌症的发生。

3，骨髓细胞姐妹染色单体分染和互换(SCD/SCE)技术证明：1)SCD阴性(细胞周期成倍延长)之MDS，转白血病的机制在于骨髓造血细胞TS基因协同扩增；2)骨髓细胞SCE水平(SCE/Cell)愈高，其原始程度愈高。换言之，干细胞有最高水平SCE，说明它最易于发生突变。鉴于国外认为癌症是干细胞基因突变所致，我们因而认为，上述内源性V-erbB突变最大可能发生于骨髓和组织干细胞。