[发明专利]一种微生物发酵高三尖杉酯碱的提取方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及微生物发酵，发酵产物的提取、分离和纯化方法，特别涉及一种微生物发酵高三尖杉酯碱的提取方法和应用。

背景技术

高三尖杉酯碱(Homoharringtonine，HHT)是从三尖杉属(Cephalotaxus)植物中分离到的一种具有抗肿瘤活性的天然生物碱。由于其广泛得抗肿瘤活性，高三尖杉酯碱及其衍生物已被用于白血病、乳腺癌、肝癌等多种肿瘤的临床研究与疾病的治疗，并显示出较好的疗效。在2012年，人工半合成的高三尖杉酯碱－Omacetaxine Mepesuccinate被美国FDA批准用于治疗人慢性粒细胞性白血病。

目前商业应用的高三尖杉酯碱主要为人工合成/半合成品或从三尖杉植物中提取。由于三尖杉生长缓慢、繁殖困难和近年来的过度采伐，天然来源的高三尖杉酯碱资源几近枯竭，而人工合成工艺复杂、成本高。来源不足与生产的高成本已成为限制高三尖杉酯碱研究与应用的瓶颈问题。

专利201210541494.5公开了一种高三尖杉酯碱侧链酸、其类似物的全合成方法，其包括9项合成步骤，总收率41％，其中的6项合成步骤需要经柱层析纯化后再进行下步合成，合成步骤复杂，反应条件较难控制，成本高。专利02150323.0公开了一种三尖杉酯碱与高三尖杉酯碱的提取方法，方法以三尖杉植物为原料，采用CO₂超临界流体萃取，4步吸附、离子树脂柱层析，再通过高速逆流色谱分离纯化，结晶、重结晶后得到三尖杉酯碱和高三尖杉酯。该方法设备要求高、工艺复杂，而且需以三尖杉植物为原料，其来源稀缺，不适于生产制备。

生物发酵生产是一些药用成分如抗生素等获取的理想方法，其具有可持续性、可大规模生产和低成本等的优势。近年来，产三尖杉酯碱的微生物陆续有报道。但是，如何从菌体以及发酵液中高效提取高纯度的三尖杉酯碱仍然有待解决。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明通过试验研究，提供了一种微生物发酵高三尖杉酯碱的提取方法和应用。

第一方面，本发明公开了一种微生物发酵高三尖杉酯碱的提取方法，包括如下步骤：

(1)对微生物发酵物进行分离，得菌体和去除菌体的发酵液，将去除菌体的发酵液浓缩，调pH值为7.0-10.0，有机溶剂萃取得有机相并蒸干，所得固体复溶解于pH为3.0-10.0复溶缓冲溶液(复溶缓冲溶液的体积优选为原发酵液体积的1/100-1/1000)中，得粗提液；

(2)将步骤(1)所得粗提液采用大孔树脂或活性炭进行吸附、解吸附得生物碱粗提取物；

(3)步骤(2)所得生物碱粗提取物经高效液相纯化获得高三尖杉酯碱；

或步骤(2)所得生物碱粗提取物先经硅胶柱层析纯化得高三尖杉酯碱粗品；高三尖杉酯碱粗品再经高效液相纯化获得高三尖杉酯碱。

在本发明的一些实施方案中，所述步骤(1)中，所述微生物为发酵产高三尖杉酯碱的细菌、真菌，优选为保藏号CGMCC No.4443的细极链格孢CH1307。

在本发明的一些实施方案中，所述步骤(1)中，将去除菌体的发酵液浓缩至原体积的20％-2％。

在本发明的一些实施方案中，所述步骤(1)中，浓缩后调发酵液pH值为7.0-10.0，优选的为7.0-8.0。

在本发明的一些实施方案中，所述步骤(1)中，所述有机溶剂为正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯中的一种或多种，优选为三氯甲烷。

在本发明的一些实施方案中，所述步骤(1)中，所述有机溶剂萃取次数为2-4次，优选为4次，并合有机相。

在本发明的一些优选实施方案中，所述步骤(1)中，所述萃取用的有机溶剂的用量为浓缩后发酵液体积的2-1/4倍，优选为1/4。

在本发明的一些实施方案中，所述步骤(1)中，复溶缓冲溶液为pH为7.0-10.0的碱性复溶缓冲溶液；进一步优选为pH为9.0的碱性复溶缓冲溶液。

本发明采用的复溶缓冲溶液可以为行业内常规的酸碱缓冲液，酸性条件优选柠檬酸缓冲溶液或醋酸缓冲液，但不限于此；碱性条件优选采用氨-氯化铵缓冲液或碳酸钠缓冲液，但不限于此。