[发明专利]折叠引物多重PCR疟疾分子诊断试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种折叠引物多重PCR疟疾分子诊断试剂盒，所述诊断试剂盒由模板缓冲液和PCR单一组合试剂组成；其中所述的模板缓冲液为1×含镁模板缓冲液1.0ml×2支，或1×含镁模板缓冲液1.0ml×1支和0.1×模板缓冲液预装0.5ml管×20支，所述预装管每管400μl；其中所述的单一组合试剂为折叠引物PCR无镁单一组合试剂200μl×1支或预装PCR管折叠引物PCR无镁单一组合试剂每管10μl×20支；其特征在于：

所述的1×含镁模板缓冲液包含以下组分：30mmol Tris-HCl；30mmol KCl；15mmol(NH₄)₂SO₄；6.6mmol MgCl₂；

所述的无镁单一组合试剂包含以下组分：具有不同退火与折叠温度的折叠引物6条；Tris-HCl 30mmol/L；KCl 30mmol/L；NH₄SO₄ 15mmol/L；TMAC 0.001mmol/L；4种核苷酸-4dNTP各200μmol/L；DNA聚合酶-Taq酶0.5U；石蜡油15μl；

所述的具有不同退火与折叠温度的折叠引物，包括疟原虫属特异公共引物一对，编号Uf-1865、Ur-2855；恶性疟原虫(PF)种特异正向引物1条，编号Ff-2545；间日疟原虫(PV)、三日疟原虫(PM)、卵形疟原虫(PO)种特异反向引物各1条，编号Vr-2343、Mr-2520、Or-2748；

所述引物的设计是在每条引物的5’端添加与3’端互补的核苷酸序列，所述3’端即第2～4碱基起至第8～18碱基，具体序列如下：

Uf-1865 5'GTCAAATGGCGTGGAAACACACTTCCCTTCTCGCCATTTGATAG 3'

Ur-2855 5'CTAAGAAGGTTCGATAACCTGTTATCCCCGGCGAACCTTCTTAC 3'

Ff-2545 5'GCTTCTGGATATTATGATAGATAACATACCAGAAG 3'

Vr-2343 5'CGGTGATGCTACTTACTTGGAGAATGTTTTGCATCACCT 3'

Mr-2520 5'GGTATAAAGGATTTTAGTTTATCTCCATGTCCTTTATACG 3'

Or-2748 5'CGGAAGGATGTAAAAGCACATTTAATATCTTATCCTTCCA 3'

所述的折叠引物中，每条属、种特异引物最佳初始退火温度间至少相差2～3℃；各条引物3’5’端互补退火的折叠温度比引物与模板靶序列的初始退火温度低1～2℃，各扩增片段之间的大小相差150bp以上。

2.如权利要求1所述的折叠引物多重PCR疟疾分子诊断试剂盒，其特征在于，所述的折叠引物中，属和种特异引物Uf-1865、Or-2748、Mr-2520、Vr-2343的浓度均为87nmol/μL；Ur-2855和Ff-2545的浓度均为70nmol/μL。

3.权利要求1或2所述的折叠引物多重PCR疟疾分子诊断试剂盒在制备同时检测和鉴定临床、流行病学样本中存在的4种疟原虫单独或混合感染产品中的用途，所述4种疟原虫为恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫，其中卵形疟原虫包括经典型和变异型。