[发明专利]折叠引物多重PCR疟疾分子诊断试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种折叠引物多重PCR疟疾分子诊断试剂盒及其检测方法，属于医学检验领域。

背景技术

感染人体的疟原虫有恶性疟原虫(PF)、间日疟原虫(PV)、三日疟原虫(PM)和卵形疟原虫(PO)4种，依次引起恶性疟、间日疟、三日疟和卵型疟。疟疾与爱滋病、结核病被列为全球三大公共卫生问题。我国曾流行前2种疟疾，自2010年起全国疟疾发病率已连续3年降至1/10万以下，我国进入消除疟疾行动阶段，但随着各种国际往来日益频繁，来自世界高疟区的4种疟原虫(包括不同虫株，混合感染和低密度带虫)，不断进入我国，2012年境外输入占全国疟疾报告病例的91.5％，恶性疟成为疟疾发病的主流，过去罕见的卵形疟和三日疟频频出现，对全面消除疟疾构成严重威胁。我国疟疾诊断面临需要快速、准确地检出至少4种疟原虫和极低原虫血症的新挑战。因此，及时发现疟疾患者，并能准确诊断和分型，是当前疟疾防治的关键，也是制定防治措施以及研制抗疟药和疫苗的迫切需要。

现有的诊断方法中，我国常规使用的厚血膜显微镜检查(镜检法)和快速诊断试验(RDT)都达不到检出低原虫血症、混合感染和准确鉴定虫种的要求。更敏感的基于PCR的分子诊断试验已有许多报告，如以18S核糖体RNA基因(rRNA)为靶基因的巢式PCR已广泛应用于研究和临床诊断，目前已被我国用作疟疾参比实验室确诊手段。但巢式PCR检测每份样本需用5管试剂做2轮PCR反应，费时、费力、且费用高，容易污染和失误，要求有设备精良的实验室和由分子诊断专业技术人员操作，另外，经证实，该法不能检出卵形疟原虫变异型，这些问题严重限制了巢式PCR的实际应用，不可能用作普通实验室常规诊断手段，也不适用于大规模筛查和监测。

消除疟疾的行动阶段为全面发现和管理疟疾病例(包括无症状帯虫者)以阻断可能的传播，需要检出极低原虫血症(低至1个虫/ul血)的诊断工具。虽有很多PCR诊断试验检出疟原虫的敏感性超过镜检法和RDT的检出极限(50-100个虫/μl血)，但目前敏感性、特异性最好的仍是作为分子诊断金标准的18S巢式PCR。现有报告巢式PCR检出滤纸血样中PF低限为6个虫和3个虫/μl血，如使用样品浓缩方法可检出0.5个虫/μl血或更低。近年报告的巢式PCR检出单一感染的4种疟原虫均达到0.4个虫/μl，也有低至0.086、0.04个虫/μl,但其测定方法都采用高密度含虫血提纯DNA进行系列稀释，不能代表现场采集的滤纸血样的实际检测结果。

混合感染是疟疾诊断的另一个难题。混合感染中各种原虫的密度可能相差悬殊，当混合感染中各种原虫高、低密度之差在10倍及以上时，传统PCR优先扩增高密度模板致迅速形成垄断，低密度虫种的扩增则受抑制甚至被完全掩盖形成假阴性。2010年Tonya M-H等用混合的实验室提取的DNA评估三种PCR(巢式，半巢式多重，和单管多重)检出模拟混合感染效率的结论是：半巢式和单管多重PCR只能检出和鉴定其中2种原虫DNA，巢式PCR是唯一能够检出和正确识别实验混合4种疟原虫DNA的最好方法。到目前为止还没有其他分子诊断试验达到或超过巢式PCR检出4种疟原虫混合感染水平的报告。

本发明人员在对巢式PCR的前期研究中，建立了标签引物-套式/多重PCR检测体系，可同时检出PF及PV，检测敏感性为PF1-2个虫/ul血，PV5-10个虫/ul血；但检测健康者血样易出现非特异扩增，检测效果不够稳定。其后，进行了新型引物的设计并试用于克服标签引物易引发其他非特异扩增的负面影响，取得明显效果，但该体系仍需两步扩增，而中途开盖加样，会增加操作污染，造成假阳性，且只能检测PV和PF。其后，在2012年研制出了快速PCR疟疾分子诊断试剂盒(专利号：201210061134.5)，使试剂复杂操作繁重的传统套式/多重PCR简化为单一试剂、单管一步反应，可同时检出和鉴定恶性疟(PF)与间日疟(PV)两种原虫的单独或混合感染，和判定三日疟(PM)或卵形疟(PO)的单独感染，但不能区分三日疟与卵形疟原虫。目前尚未见有单管一步扩增可同时检出和鉴定4种人疟原虫及其混合感染的疟疾分子诊断技术的报告。

发明内容

本发明的目的：为克服现有巢式PCR同时检测4种疟原虫的诊断实验需多管两步扩增，试验时间长且试剂、操作复杂，需中间开管二次加样，容易污染和失误；而单管一步反应的快速PCR只能检出和鉴定PF与PV两种疟原虫的缺陷；提供一种单管一步扩增能同时检出和鉴定4种疟原虫的单一和混合感染、既灵敏、准确又简便、快捷的折叠引物多重PCR疟疾分子诊断试剂盒。

本发明的技术方案如下：