[发明专利]粪便DNA定量甲基化特异性PCR检测试剂盒及其用途

权利要求书

1.一种粪便中结肠肿瘤发病相关抑癌基因表观突变检测试剂盒，其特征在于包括以下成分：

（1）结肠肿瘤发病相关的抑癌基因启动子区CpG岛定量甲基化扩增引物3对、探针3条；（2）PCR扩增用试剂；

所说的3对定量甲基化扩增引物序列如下：

第1对：SPG20基因qMSP分析引物SPG20-qMSP，用于扩增SPG20基因启动子区CpG位点处胞嘧啶甲基化的片段；

F: 5'- TGACGCGAAGCGTTCGAGAGCGCG-3'

R: 5'- CGCTCGCCGAAAACCGATCCCGAA-3'；

第2对：SNCA基因qMSP分析引物SNCA-qMSP，用于扩增SNCA基因启动子区CpG位点处胞嘧啶甲基化的片段；

F: 5'- TTTTTGTTTTTTTATTTTCGTGAGC-3'

R: 5'- AAAAAAAACCGCTATAAACCGAC-3'；

第3对：FBN1基因qMSP分析引物FBN1-qMSP，用于扩增FBN1基因启动子区CpG位点处胞嘧啶甲基化的片段

F: 5'- GGTAGAGATTGTGGGTGTTATAAGC -3'

R: 5'- ACTAAAAAAACGACGACTCCG -3'；

所说的3条定量甲基化分析探针序列如下：

第1条：SPG20基因qMSP分析探针SPG20-probe，用于分析SPG20基因启动子区CpG位点处胞嘧啶甲基化的片段；

5'-6FAM-CGTAACAACCAAAACGTTCCACG -TAMRA -3'  ；

第2条：SNCA基因qMSP分析探针SNCA-probe，用于分析SNCA基因启动子区CpG位点处胞嘧啶甲基化的片段；

5'-6FAM-CGCTAACCTATCGTCGAATAACC -TAMRA -3'；

第3条：FBN1基因qMSP分析探针FBN1-probe，用于分析FBN1基因启动子区CpG位点处胞嘧啶甲基化的片段

5'-6FAM-CGACGACGACTACTCCCAATCG-TAMRA -3'。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，包括亚硫酸氢盐修饰试剂、PCR扩增试剂为dNTP、Ex Taq Hot Start、Premix Ex Taq^TM 聚合酶。

3.权利要求1-2之一所述的试剂盒用于检测粪便中结肠肿瘤发病相关抑癌基因表观突变。

4.根据权利要求3所述的试剂盒的应用，其特征是检测基因启动子区CpG岛甲基化步骤如下：

提取粪便样本肠粘膜组织DNA；

（2）DNA亚硫酸氢盐修饰：经过磺化、水解脱氨和碱性条件下去磺化三个主要步骤，将非甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶；而5-甲基-胞嘧啶不能进行该反应；

（3）基因启动子区CpG岛甲基化分析：

采用定量甲基化特异性PCR，适用于基因CpG岛甲基化筛查；

针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA序列设计引物及探针；引物及探针在CpG二联核苷处，设计为CG，只能扩出甲基化的DNA；将待测样本DNA结果与甲基化阳性对照比较，用这种特异性扩增的方法来定量检测DNA中胞嘧啶的甲基化情况；

qMSP法的具体步骤为：

A. qPCR扩增反应体系，

根据所述引物及探针，反应体系为10μl ：TaKaRa Premix Ex Taq^TM聚合酶5μl、上

游引物（0.9μM）0.9μl、下游引物（0.9μM）0.9μl、TaqMan探针（3μM）0.4μl、亚硫酸氢盐修饰DNA (200ng/μl) 2.6μl、ROX Ref 0.2μl；

B. qPCR反应条件：

95℃预变性30 sec；95℃变性10 sec，60℃左右复性30 sec，其中ACTIN50℃，ALU55℃，SNCA60℃或55℃，SPG20 55℃；在实时定量PCR仪上完成。