[发明专利]粪便DNA定量甲基化特异性PCR检测试剂盒及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种粪便中结肠肿瘤发病相关抑癌基因表观突变检测试剂盒，特别涉及其在中国肠癌患病人群的表观突变分析与后果评估。

背景技术

结直肠癌是我国大中城市发病居第二、三位的主要恶性肿瘤，早期发现、早期治疗的效果比较理想。因此，寻找一种无创型的，具有高灵敏度及特异性的早期检测方法显得尤其重要。

已知抑癌基因的表观突变是癌症发生的早期事件，DNA启动子区的异常甲基化可导致相关基因的沉默或低转录活性，使相关蛋白的表达异常，引发癌症。研究发现，肠癌发病相关抑癌基因SPG20、SNCA及FBN1等特定启动子内CpG岛区域的甲基化水平在患者瘤组织和正常肠粘膜组织中差异明显，提示表观遗传标记物在结直肠癌早期诊断中的可能价值。肠黏膜的周期性脱落会随粪便排出体外，藉此，可利用粪便中相关基因qMSP及BSP方法检测DNA甲基化水平，开发一种方便快捷的结肠肿瘤早期筛查方法。

发明内容

本发明的目的是，提供一种粪便中结肠肿瘤发病相关抑癌基因表观突变检测试剂盒及其应用。

本发明的技术方案是：粪便DNA定量甲基化特异性PCR检测试剂盒，包括以下成分：

(1)肠癌发病相关的3种抑癌基因启动子区CpG岛定量甲基化扩增引物3对及探针3条，各对引物序列见表1；

(2)PCR扩增试剂，如dNTP、Ex Taq Hot Start、Premix Ex Taq^TM聚合酶等。

表1 CpG岛扩增引物及探针序列

本试剂盒扩增出的PCR产物可以采用定量甲基化特异性PCR(quantitative methylation specific PCR,qMSP)进行基因CpG岛甲基化检测。因此，试剂盒中，还可以有亚硫酸氢盐修饰试剂和PCR扩增试剂：包括dNTP、Ex Taq Hot Start、Premix Ex Taq^TM聚合酶。

本发明所说的试剂盒用于检测粪便肠粘膜中肠癌发病相关抑癌基因启动子区CpG岛甲基化状态。

本试剂盒的检测基因启动子区CpG岛甲基化步骤包括：

(1)提取粪便样本肠粘膜组织DNA。

(2)DNA亚硫酸氢盐修饰：按照CHEMICON公司CpGenome^TM DNA修饰试剂盒说明书操作步骤，经过磺化、水解脱氨和碱性条件下去磺化三个主要步骤，将非甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。而5-甲基-胞嘧啶不能进行该反应。

(3)基因启动子区CpG岛甲基化分析：

采用定量甲基化特异性PCR(quantitative methylation specific PCR,qMSP)，适用于基因CpG岛甲基化筛查。

针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA序列设计引物及探针。引物及探针在CpG二联核苷处，设计为CG，只可以扩出甲基化的DNA。将待测样本DNA结果与甲基化阳性对照比较，用这种特异性扩增的方法来定量检测DNA中胞嘧啶的甲基化情况。

qMSP法的具体步骤为：

A.qPCR扩增反应体系：

引物及探针如表1所示。反应体系为10μl：TaKaRa Premix Ex Taq^TM聚合酶5μl、上

游引物(0.9μM)0.9μl、下游引物(0.9μM)0.9μl、TaqMan探针(3μM)0.4μl、亚硫酸氢盐修饰DNA(200ng/μl)2.6μl、ROX Ref 0.2μl。

B.qPCR反应条件：

95℃预变性30 sec；95℃变性10 sec，60℃左右复性30 sec(ACTIN50℃，ALU55℃，SNCA60℃或55℃，SPG2055℃)。

(4)统计分析

I.百分甲基化参考值(Percent methylated reference，PMR)计算:

采用2^-ΔΔCT法以[(待测样本的基因:ACTIN)/(甲基化阳性对照样本的基因:ACTIN)]×100计算PMR值。

II.接收者工作特征曲线(Receiver operating characteristic，ROC)分析标志基因的诊断价值：将肠癌患者及正常对照粪便肠粘膜DNA各标志基因PMR值带入计算，获得多对灵敏度及1-特异度值，绘制ROC曲线。

III.采用卡方检验及费歇尔确切概率法检验分析分类资料间差异。