[发明专利]一种鉴定不同烟草品种的引物组、试剂盒及其方法

说明书

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，特别地，本发明涉及烟草生物技术领域，更特别地，本发明涉及一组引物组、一种试剂盒、引物组或者试剂盒在鉴别烟草品种和/或确定不同烟草品种亲缘关系中的用途、一种鉴别烟草品种的方法和一种确定不同烟草品种亲缘关系的方法。

背景技术

在烟叶生产和卷烟配料过程中对烟草品种进行鉴别是非常重要的，只有这样才能保证卷烟原料品种的准确性。而当前使用的烟草品种鉴别方法主要依据田间农艺性状、初烤烟叶外观等，鉴别较难而且不准确，特别是对外观性状差异较小的品种，根据形态特征和农艺性状很难鉴别。因此,利用分子标记技术开发准确、简单、快速和高效的品种鉴别技术对促进烟叶和卷烟生产具有重要意义。马林等[烟草品种的SCAR标记鉴别，《中国烟草学报》2012年，第5期，79-84页]利用6对SCAR引物对12个烟草品种复烤叶片的基因组DNA进行SCAR-PCR扩增分析，根据6个SCAR标记在不同烟草品种中的扩增差异，建立了12个烟草品种的分子ID和鉴别路线，虽然能将12个品种完全鉴别开来，但是鉴别路线非常繁琐，导致鉴别效率低下。因此，开发一种高效并节约成本的鉴别方法是十分必要的。

其次，烟草品种资源是烟草品种改良的物质基础，关系到烟草育种的成败。对烟草品种资源进行亲缘关系与遗传多样性分析，可为品种资源在烟草育种中的利用提供重要的生物学和遗传学信息。目前我国烟草品种资源库共收集到5210份资源，是世界上烟草品种资源保存数量最多的国家，20世纪90年代以来品种资源的研究也已从形态学、细胞学、生理生化等方面逐渐发展为以分子标记技术为核心的分子水平。目前，烟草遗传多样性与亲缘关系分析研究中的分子标记主要以ISSR、SRAP、RAPD、AFLP为主,都采用的是单重PCR技术，扩增效率有待进一步提高。

多重引物PCR扩增技术(简称“多重PCR”)是指在普通PCR的基础上加以改进,于一个PCR反应体系中加入两对及以上的引物,针对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的一类特殊PCR技术。该技术能够适应高通量DNA指纹分析的需要，节省DNA模板和试验耗材，简化操作步骤，加速试验进程。目前烟草多重引物PCR技术开发应用仅仅在烟草病毒检测、烟草转基因检测等方面有报道，而在烟草品种鉴别、烟草亲缘关系与遗传多样性分析方面还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过DNA分子标记快速高效鉴别不同烟草品种或鉴定烟草品种资源亲缘关系与遗传多样性的方法。

依据本发明的一方面，本发明提供一组引物组，其特征在于，所述引物组包括，引物一，引物二，引物三和引物四的组合；和/或引物五和引物六的组合。

所述引物一由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2组成，所述引物二由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4组成，所述引物三由SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6组成，所述引物四SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成。引物一、引物二、引物三和引物四中的任意两个、任意三个以上或者全部四个都能够在同一PCR反应体系、同一反应条件下各自特异性结合到模板的不同区域同时进行扩增反应，且扩增产物易于区分，这四个引物及其组合是发明人基于不同烟草基因组DNA序列，经过长时间设计、优化以及大量组合试验筛选验证获得的。

根据本发明的一个实施例，该引物组还包括引物五和引物六，所述引物五由SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10组成，所述引物六由SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12组成。引物五和引物六能够在同一PCR反应体系、同一反应条件下各自特异性结合到模板的不同区域同时进行扩增反应，且扩增产物易于区分开，这两个引物及其组合是发明人基于不同烟草基因组DNA序列，经过长时间设计、优化以及大量试验筛选和验证获得的。