[发明专利]一种海洋芽孢杆菌多肽及其制备和应用

权利要求书

1.一种海洋芽孢杆菌多肽，其特征在于所述多肽来源于南极的海洋芽孢杆菌N11-8发酵培养后的代谢产物，所述多肽的N-端15个氨基酸序列为ASTGSQKVTVYAVAD；所述多肽的分子量，ESI质谱显示19kDa，SDS-PAGE电泳显示15.8kDa。

2.根据权利要求1所述的一种海洋芽孢杆菌多肽，其特征在于所述海洋芽孢杆菌N11-8的发酵培养条件为，发酵液中各成分的终浓度为牛肉膏1～6g/L、蛋白胨7.5～12.5g/L、氯化钠2～7g/L、pH6.0～8.0，在1.05kg/cm²，115～121℃，15～35min的条件下灭菌，在150～250r/min、20～33℃的条件下在恒温震荡摇床中培养48～72h。

3.根据权利要求1所述的一种海洋芽孢杆菌多肽，其特征在于所述多肽的获得方法为将海洋芽孢杆菌N11-8发酵培养后的代谢产物过超滤膜，取分子量为3～30kDa的组分，将分子量为3～30kDa的组分用硫酸铵沉淀，获得硫酸铵的质量百分比浓度小于45～60％的样品溶液，将所述溶液进行阴离子交换层析，经MTT法检测各峰组分的抗肿瘤活性，显示穿透峰Q2具有最佳抗肿瘤活性，选取穿透峰Q2的样品，进行亲水分子排阻色谱层析，流动相A为甲醇，流动相B为超纯水，上样量100～500μL，程序为：流速2～5mL/min，0～10min，A从0升到5％，B从100％降到95％，10～15min，A保持为0，B保持为100％；检测波长为280nm，收集各峰，检测各峰组分的抗肿瘤活性，峰P1和峰P2有活性，其中峰P1活性最佳，将其命名为海洋芽孢杆菌多肽，简称PBN11-8。

4.权利要求1所述的一种海洋芽孢杆菌多肽的制备方法，其特征在于它的具体步骤为：

(1)发酵培养

将海洋芽孢杆菌N11-8发酵，发酵条件：发酵液中各成分的终浓度为牛肉膏1～6g/L、蛋白胨7.5～12.5g/L、氯化钠2～7g/L、pH6.0～8.0，在1.05kg/cm²，115～121℃，15～35min的条件下灭菌，在150～250r/min、20～33℃的条件下在恒温震荡摇床中培养48～72h；

(2)超滤分离

将海洋芽孢杆菌N11-8的发酵液，在8000～10000g，8～15min条件下离心，收集上清液，用分子量为3kDa和30kDa的超滤膜超滤，获得分子量小于3kDa、3～30kDa和大于30kDa的不同组分，MTT法检测各组分的抗肿瘤活性，结果表明分子量3～30kDa之间的组分抗肿瘤活性最佳；

(3)硫酸铵沉淀

将上述分子量3～30kDa的活性组分搅拌，添加硫酸铵粉末，使其浓度达到45～60％(质量百分比浓度)，期间控制温度3～6℃，全部溶解后冰箱静置2～4h，在10000～12000rpm，25～35min的条件下离心，收取沉淀，使用两倍于沉淀体积的10～30mM pH7.5～8.5Tris-HCl溶解，将收到的小于45～60％(质量百分比浓度)的样品透析；将上一步得到的上清液继续添加硫酸铵粉末，使其浓度达到70～80％(质量百分比浓度)，期间控制温度3～6℃，全部溶解后冰箱静置2～4h，在10000～12000rpm，25～35min的条件下离心，收取沉淀，使用两倍于沉淀体积的10～30mM pH7.5～8.5Tris-HCl溶解，将收到的大于45～60％(质量百分比浓度)小于70～80％(质量百分比浓度)的样品透析；将上一步得到的上清液继续添加硫酸铵粉末，使其浓度达到85～95％(质量百分比浓度)，期间控制温度3～6℃，全部溶解后冰箱静置2～4h，在10000～12000rpm，25～35min的条件下离心，收取沉淀，使用两倍于沉淀体积的10～30mM pH7.5～8.5Tris-HCl溶解，将收到的大于70～80％(质量百分比浓度)小于85～90％(质量百分比浓度)的样品透析，MTT法测定各组分的细胞毒性，结果表明小于45～60％(质量百分比浓度)的样品抗肿瘤活性最佳；

(4)阴离子交换层析

将硫酸铵沉淀获得的具有最佳抗肿瘤活性的组分，溶于上样缓冲液中，上样缓冲液为10～30mmol/L pH7.5～8.5三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液，在10000～12000rmp，15～25min的条件下离心，过0.22μm微孔滤膜；过DEAE或Q阴离子交换层析柱，每次上样量为5～50mL，洗脱液为含1～2mol/L NaCl的10～30mmol/L pH7.5～8.5Tris-HCl，洗脱液以0-100％(v/v)的浓度进行洗脱，流速为3-6mL/min，检测波长为280nm，收集穿透峰Q1、穿透峰Q2和洗脱峰Q3，检测各峰组分的抗肿瘤活性，发现穿透峰Q1和穿透峰Q2有活性，其中穿透峰Q2活性最佳；

(5)制备型高压液相亲水分子排阻色谱层析

选取穿透峰Q2的样品，进行亲水分子排阻色谱层析，流动相A为甲醇，流动相B为超纯水，上样量100～500μL，程序为：流速2～5mL/min，0～10min，A从0升到5％，B从100％降到95％，10～15min，A保持为0，B保持为100％；检测波长为280nm，收集各峰，检测各峰组分的抗肿瘤活性，峰P1和峰P2有活性，其中峰P1活性最佳，将其命名为海洋芽孢杆菌多肽，简称PBN11-8；

(6)电泳纯检测样品纯度和分子量

采用Laemmli法，SDS-PAGE不连续凝胶电泳，浓缩胶浓度为5％(质量百分比浓度)，分离胶浓度为12％(质量百分比浓度)，将发酵浓缩液、硫酸铵沉淀小于45～60％(质量百分比浓度)的样品、穿透峰Q2样品和PBN11-8，SDS-PAGE电泳显示，PBN11-8为单一条带，其对应的分子量为15.8kDa；

(7)分析型高压液相进一步检测PBN11-8纯度

将PBN11-8进行亲水分子排阻色谱层析，流动相为超纯水，上样量10-20μL，流速2～5min，检测波长为280nm，色谱显示多肽PBN11-8为单一峰；

(8)ESI质谱检测PBN11-8的分子量

采用Bruker的Q-TOF质谱仪，型号maXis，将PBN11-8进行ESI质谱检测，测定分子量为19kDa；

(9)PBN11-8的N-端氨基酸测序

通过Edman化学降解法，测得PBN11-8的N-端15个氨基酸的序列是ASTGSQKVTVYAVAD。