[发明专利]一种海洋芽孢杆菌多肽及其制备和应用

说明书

技术领域

本发明属于海洋微生物医药技术领域，具体地涉及一种海洋芽孢杆菌多肽及其制备和应用。

背景技术

恶性肿瘤是严重危害人类健康的重大疾病，是我国人口死亡的主要原因之一，2005年全球共有约750万人死于恶性肿瘤，我国每年约有130万人死于癌症，而且发病率呈逐年上升趋势。药物治疗是恶性肿瘤综合疗法中的重要组成部分，经典的细胞毒类抗肿瘤药物是目前化学治疗的主要手段，并在未来的相当长时期内仍将占据主导地位。因此从天然生物中寻找新的结构类型或新的作用机制的抗肿瘤活性成分是当前抗肿瘤药物研究的新趋势。但是绝大多数的抗肿瘤先导化合物在生物体内含量低，规模化制备困难，所以目前天然来源的抗肿瘤先导化合物的药物来源是一大难题。由于海洋独特的地理、气候及环境特点，海洋微生物也具有新颖性与多样性，这在科学研究、应用开发等方面都具有重要价值。海洋因此被认为是个潜在、重要的微生物资源库，可能是产生具有新型生物活性物质的菌株的潜在种源地，将会给新型天然药物的筛选与发现带来新的机遇与突破。海洋环境的特殊性及海洋微生物的多样性，使得从海洋微生物活性代谢产物中寻找新的抗肿瘤活性的药物先导化合物成为目前研究的热点。南极由于其独特的地理和气候环境，使生长于其中的微生物具备了相应的生理生化特性，且成为新微生物物种的重要来源地。目前对微生物的研究已经不仅仅局限于其基础研究，抗冻、抗辐射、抗肿瘤及抗菌等菌株也被不断发 现，且其产生的活性物质将极可能成为新的药用活性物质，有良好的研究及开发前景。美国专利检索产生抗肿瘤活性物质的海洋微生物已授权相关专利5项，2004年Fenical等发现了一种新型的海洋放线菌CNQ140，从中获得了环多烯类的天然产物，具有显著的抗肿瘤活性(Patent No.US7521414B2)。国内检索产生抗肿瘤活性物质的海洋微生物已授权相关专利2项，2007年东南大学的杨瑞丽等发现了一种产生抗肿瘤活性物质的海洋链霉菌,该菌的发酵液对多种肿瘤细胞均具有显著的细胞毒作用，并且能诱导肿瘤细胞凋亡，是一株具有预防和治疗肿瘤潜力的菌株资源(授权公告号：100554404)；2003年中国科学院海洋所的秦松等将海洋链霉菌Streptomyces sp.经发酵积累粗提物，利用硅胶层析等多种层析方法分离得到两种化合物，命名为chinikomycin A和B，其对多种人体肿瘤细胞有抑制作用(授权公告号：1296347)，国内在评审中的相关专利有7项。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种海洋芽孢杆菌多肽及其制备和应用。

一种海洋芽孢杆菌多肽，所述的多肽来源于南极的海洋芽孢杆菌N11-8(Bacillus sp.N11-8)发酵培养后的代谢产物，该活性多肽的分子量，ESI质谱显示19kDa，SDS-PAGE电泳显示15.8kDa；该活性多肽的N-端15个氨基酸序列为ASTGSQKVTVYAVAD。

进一步，所述海洋芽孢杆菌N11-8的发酵培养条件为，发酵液中各成分的终浓度为牛肉膏1～6g/L、蛋白胨7.5～12.5g/L、氯化钠2～7g/L、pH6.0～8.0，在1.05kg/cm²，115～121℃，15～35min的条件下灭菌，在150～250r/min、20～33℃的条件下在恒温震荡摇床中培养48～72h。

进一步，所述多肽的获得方法为将海洋芽孢杆菌N11-8的发酵培养后的代谢产物过超滤膜，取分子量为3～30kDa的组分，将分子量为3～30kDa的组分用硫酸铵沉淀，获得硫酸铵的浓度小于45～60％(质量百分比浓度)的样品溶液， 将所述溶液进行阴离子交换层析，经MTT法检测各峰组分的抗肿瘤活性，显示穿透峰Q2具有最佳抗肿瘤活性，选取穿透峰Q2的样品，进行亲水分子排阻色谱层析，流动相A为甲醇，流动相B为超纯水，上样量100～500μL，程序为：流速2～5mL/min，0～10min，A从0升到5％，B从100％降到95％，10～15min，A保持为0，B保持为100％；检测波长为280nm，收集各峰，检测各峰组分的抗肿瘤活性，峰P1和峰P2有活性，其中峰P1活性最佳，将其命名为海洋芽孢杆菌多肽(Peptide from marine Bacillus sp.N11-8，简称PBN11-8)。

本发明还提供一种海洋芽孢杆菌多肽的制备方法，其步骤为：

(1)发酵培养