[发明专利]基于利用黄杆菌原位发酵分离偶联合成维生素K2的方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种基于利用黄杆菌原位发酵分离偶联合成维生素K₂的方法。

背景技术

维生素K2(menaquinone，简写为MK，甲萘醌类)，是一种具有叶绿醌生物活性的萘醌基团的衍生物，脂溶性维生素。依据C-3上异戊二烯侧链长度的不同，MK共有14种，通常以MK-n表示，其中n指的是侧链上异戊二烯单元的个数。MK-4，MK-7，MK-9生物活性均大幅高于维生素K1。在人体正常代谢和肠胃功能正常状态时，维生素K1和维生素K3、维生素K4将在肠道正常菌群参与下转化为维生素K2活性体后才会被肠道吸收利用。维生素K2具有良好的促进凝血、预防和治疗骨质疏松的功效.

能够进行发酵生产维生素K2的菌种有属于革兰氏阴性菌的黄杆菌(Flavobacterium.sp)，主要产MK-4和MK-6；属于革兰氏阳性菌的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto，日本文献称之为纳豆菌)，主要产MK-7。另外据报道一些乳酸杆菌在脱脂奶粉和豆奶中能产生29-123μg/L的MK-8、9、10，但是因为产量较低，一般作为食品添加剂而不能作为发酵生产使用。

根据专利及文献报导，黄杆菌在发酵过程中，适当表面活性剂可以提高MK-4及MK-6的产量。其原因是添加表面活性剂可以使MK-4及MK-6漏出到胞外，能在一定程度上解除产物抑制，从而提高产量。但随着胞外维生素K2浓度逐渐提高，由胞内扩散至胞外的速率会下降，进而影响产率。而且，维生素K2如何有效提取也是迫切需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种基于利用黄杆菌原位发酵分离偶联合成维生素K₂的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种基于利用黄杆菌原位发酵分离偶联合成维生素K₂的方法，包括如下步骤：种子培养、接种培养、发酵培养和静置分层提取维生素K₂，发酵培养过程中，将接种培养后的发酵培养基中加入活性成分，所述活性成分由以下组分组成：10g/L-60g/L表面活性剂、5g/L-40g/L甘油和100g/L-250g/L植物油。

优化的，一种基于利用黄杆菌原位发酵分离偶联合成维生素K₂的方法，具体包括如下步骤：

(1)种子培养，从保存斜面上取一环黄杆菌接种于含有50-150mL种子培养基的500mL三角瓶中，在温度为30-37℃条件下，以转速100-200rpm振荡培养24-48h；

所述种子培养基由以下组分组成：1-5g/L葡萄糖、2-10g/L甘油、10-20g/L蛋白胨、1.5-4g/L酵母提取物、1-4g/L K₂HPO₄、1-3g/L NaCl和0.1-1g/L MgSO₄·7H₂O；

(2)接种培养，按接种量5％-10％接入发酵罐中的发酵培养基中，在培养温度30-37℃、条件下，以转速100-200rpm、通气量0.5-1vvm搅拌培养24-36小时；

所述发酵培养基由以下组分组成：5-30g/L黄豆粉、0-10g/L葡萄糖、10-20g/L蛋白胨、3-10g/L酵母提取物、1-3g/L K₂HPO₄、1-4g/L NaCl、0.1-1g/L MgSO₄·7H₂O；

(3)发酵培养，将接种培养后的发酵培养基中加入10g/L-60g/L表面活性剂、5g/L-40g/L甘油和100g/L-250g/L植物油，且搅拌速率500-800rpm，通气量1.5-3vvm搅拌，形成水包油微乳，发酵培养72-96小时；

(4)静置分层提取，将经步骤(3)发酵培养的混合物停止搅拌，静置3-5小时分层后，提取上层植物油，油相中含有总维生素K2。

作为上述方案的进一步优化，上述步骤(3)中表面活性剂选自蔗糖脂肪酸酯(SE)、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯-80(Tween80)、聚辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯(Labrasol)中的一种或几种。

作为上述方案的进一步优化，上述步骤(3)中植物油选自大豆油，玉米油，花生油，橄榄油、山茶油等中的一种或几种。