[发明专利]一种凹叶厚朴再生体系构建的方法

说明书

技术领域

    本发明涉及农业生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种凹叶厚朴再生体系构建的方法。

背景技术

 凹叶厚朴（Magnolia officinalissubsp. biloba（Rehd. et Wils.) Law.））又称庐山厚朴，是厚朴的一个亚种。为我国特有经济树种，是国家二级重点保护植物，集药用、材用、观赏于一体的珍稀濒危植物，主要分布湖南、湖北、广西等地。凹叶厚朴根皮、树皮、花、芽及种子均可入药，具有抗菌、抗溃疡、肌肉松驰、抗痉挛、抗过敏等作用，是胃肠道疾病常用中药。

目前，凹叶厚朴主要依靠种子繁殖方式进行种苗生产，存在繁殖周期长、效率低、繁殖系数低等问题，尚未形成健全的产业化生产机制。近年来，由于凹叶厚朴需求量逐渐增加，野生资源逐渐减少，其种子本身又具深度休眠特性，自然繁殖率普遍较低。另外，凹叶厚朴作为木兰科较为原始的木本植物，组织培养较为困难。因此，非常有必要建立一套完整的凹叶厚朴组织培养快繁体系。

发明内容

    本发明的目的在于提供一种凹叶厚朴再生体系构建的方法，本发明以凹叶厚朴为最初外植体，通过无菌体系建立、初代培养、丛生芽增殖培养、丛生芽壮苗培养、试管苗生根以及试管苗驯化移栽等过程建立了凹叶厚朴的再生体系，为凹叶厚朴优质种源的快速繁殖提供生产方法，进而实现了本发明的目的。

本发明的一种凹叶厚朴再生体系构建的方法，包括以下的工艺步骤：

（1）无菌体系建立：选取成熟饱满、完整无病虫害的种凹叶厚朴种子，在自来水下初步清洗干净。种子以0.1%～0.5%高锰酸钾溶液浸泡2～5h，直至高锰酸钾溶液的颜色变浅至粉红色，经自来水冲洗干净后在75%乙醇溶液中消毒1～5min，无菌水冲洗4～5次，无菌滤纸沥干，人工去外种皮，接种到萌发培养基上进行启动培养。

（2）初代培养：将无菌体系培养的萌发子叶未脱落的无菌苗接种到初代培养基上进行培养，接种后先在25～28℃条件下全暗培养7～14天，然后置于每天光照12～15小时，光照强度为1500～2500lx，培养温度为25～28℃的条件下培养，30～40天转接一次。

（3）丛生芽增殖培养：将初代培养的无菌苗无顶芽长度为1.5～2.0cm的茎段接种到增殖培养基上进行增殖培养，接种后先在25～28℃条件下全暗培养7～14天，然后置于每天光照12～15小时，光照强度为1500～2500lx，培养温度为25～28℃的条件下培养，30～40天转接一次。

（4）丛生芽壮苗培养：将丛生芽增殖得到的不定芽，切除基部少量愈伤组织，去除底部叶片后接种到壮苗培养基上进行壮苗培养，接种后先在25～28℃条件下全暗培养7～14天，然后置于每天光照12～15小时，光照强度为1500～2500lx，培养温度为25～28℃的条件下培养，30～40天转接一次。

（5）试管苗生根：将长至1.5～2.0cm的,叶片数不少于3片，植株较健壮的无根苗分切接种到生根培养基上进行诱导生根，接种后先在25～28℃条件下全暗培养7～14天，然后置于每天光照12～15小时，光照强度为2000～3000lx，培养温度为25～28℃的条件下培养至生根。

（6）试管苗驯化移栽：将长至6～8cm的生根试管苗的培养瓶瓶盖打开并置于自然光照下炼苗5～7天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入由黄沙土和火碳泥（1：1）混合成的基质中并定植于大田中。

 上述步骤（1）所述的萌发培养基为：3/4B₅ + 0.1～0.5mg/L 6-BA+0.1～0.2mg/L NAA +2.5%～3.5%蔗糖+0.35%～0.5%琼脂+0.05%～0.1%活性炭，pH值为5.4～5.8。

 上述步骤（2）所述的初代培养基为：B₅+1～4mg/L 6-BA+1～1.5mg/L 2,4-D+2.5%～3.5%蔗糖+0.35%～0.5%琼脂+0.05%～0.1%活性炭，pH值为5.4～5.8。

 上述步骤（3）所述的增殖培养基为：MS+1～2mg/L KT+1～1mg/L NAA+1～3mg/L 6-BA+2.5%～3.5%蔗糖+0.35%～0.5%琼脂+0.05%～0.1%活性炭，pH值为5.4～5.8。