[发明专利]用于检测树鼩副粘病毒的PCR试剂盒及其专用引物

权利要求书

1.用于树鼩副粘病毒PCR检测的引物，是以树鼩副粘病毒血凝素基因组序列自5’端第8231-8720bp区域(序列表中SEQ ID NO：1)为对象设计的，用以检测样本中是否存在树鼩副粘病毒污染，所述引物的上游引物453-F2具有序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，下游引物453-R2具有序列表中SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

2.用于检测树鼩副粘病毒的PCR试剂盒，包括权利要求1所述用于对树鼩副粘病毒进行PCR检测的引物。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括逆转录反应试剂和PCR反应试剂：

25μl逆转录反应试剂包括：5×buffer(Promega AMV Transcriptase，catalog#M5108)5μl，dNTP(浓度2.5mM)4μl，随机引物(浓度500ug/mL)0.5μl，AMV(浓度10U/ul)0.5μl，去Rnase的dH₂O 7μl；

25μl PCR反应试剂包括：HS Taq酶(浓度5u/μl)0.15μl，10×buffer(TaKaRa Taq^TM Hot Start Version DR007A)2.5μl，dNTP(浓度2.5mM)2μl，ddH₂O 17.35μl，上游引物453-F2(浓度10μM)1μl，下游引物453-R2(浓度10μM)1μl。

4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于：为方便检测，所述试剂盒中还可包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为树鼩副粘病毒阳性质粒，所述阴性对照为不含DNA的PCR扩增体系，如双蒸水。

5.权利要求1所述PCR引物和权利要求2-4任一所述试剂盒在树鼩副粘病毒PCR检测中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述树鼩副粘病毒的PCR检测方法，包括以下步骤：

1)提取样本RNA；

2)以样本RNA为模板逆转录合成其cDNA；

3)PCR检测：以步骤2)获得的cDNA为模板，在上述专用引物的引导下进行PCR扩增，反应结束后对PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，若能扩增出长度为453bp的目的片段，则检测结果为阳性，反之为阴性。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述步骤1)的样本是从树鼩身上分离得到的血液、粪便或肾组织。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述步骤2)中是在合适的反应体系中，通过逆转录酶的催化，以样本RNA为模板合成其DNA(cDNA)的过程，所述25μl逆转录反应体系为：样本RNA(浓度0.25ug/ul)8μl，5×buffer(Promega AMV Transcriptase，catalog#M5108)5μl，dNTP(浓度2.5mM)4μl，随机引物(浓度500ug/mL)0.5μl，AMV(浓度10U/ul)0.5μl，去Rnase的dH₂O 7μl；所述逆转录反应条件为：37℃90min，72℃15min，4℃5min。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述步骤3)是以样本RNA的逆转录产物为模板，在合适的反应体系中，用本发明的特异性引物与cDNA相应位置互补结合，经过DNA的变性(基因组双链解成单链)、退火(引物与模板结合)、延伸(从引物3’端合成新链)3个阶段的循环重复，目的片段被放大，再通过琼脂糖凝胶电泳进行树鼩副粘病毒的定性检测；所述25μl PCR反应体系包括：cDNA(浓度50ng/μl)1μl，HS Taq酶(浓度5u/μl)0.15μl，10×buffer(TaKaRa Taq^TM Hot Start Version DR007A)2.5μl，dNTP(浓度2.5mM)2μl，ddH₂O 17.35μl，上游引物453-F2(浓度10μM)1μl，下游引物453-R2(浓度10μM)1μl；所述PCR反应条件为：先94℃5min；然后94℃1min，48℃1min，72℃1min，共35个循环；最后72℃10min。

10.根据权利要求6-9任一所述的应用，其特征在于：所述步骤3)PCR反应体系中还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为树鼩副粘病毒阳性质粒，所述阴性对照为不含DNA的PCR扩增体系，如双蒸水。