[发明专利]用于检测树鼩副粘病毒的PCR试剂盒及其专用引物

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域中病毒的检测方法，特别是涉及一种树鼩副粘病毒(TPMV)的PCR试剂盒及其专用引物与其在检测树鼩副粘病毒中的应用。

背景技术

树鼩副粘病毒(TPMV)是1999年首次由Tidona等人从曼谷捕获的健康野生树鼩的肾组织中分离得到病原体，随后在树鼩成纤维细胞和树鼩肾细胞中培养增殖(Tidona CA,Kurz HW,Gelderblom HR,et al.Isolation and molecular characterization of a novel cytopathogenic paramyxovirus from tree shrews.Virology,1999,258(2):425-434.)。由于其在电镜下呈副粘病毒样多形性包膜和螺旋样核衣壳，因此被命名为树鼩副粘病毒。

树鼩副粘病毒RNA序列长度为17904bp，包括两个不重叠的开放读码框架(对应为N蛋白和P/V/C蛋白)。树鼩副粘病毒的编码策略和显著氨基酸序列同源性清楚地表明树鼩副粘病毒和麻疹病毒属之间的进化关系。此外，树鼩副粘病毒和亨德拉病毒(马麻疹病毒)也具有高同源性。

树鼩副粘病毒与已知副粘病毒均无血清学交叉反应，由于这一血清学特性，目前被作为溶瘤病毒载体进行基因改造，运用于靶向杀死癌症细胞研究，具有广阔的临床应用价值。

目前，国外报道的树鼩副粘病毒特异性检测方法还是病毒的分离和鉴定。国内尚未有报道分离出树鼩副粘病毒，尚无树鼩副粘病毒毒株。国内外尚未报道树鼩副粘病毒的分子生物学检测方法。

发明内容

针对以上问题，发明人通过对树鼩副粘病毒的分子生物学检测方法进行研究，提出了一种PCR检测方法，由于其具有特异性、灵敏度高、快速简便等优点，为将其运用于树鼩副粘病毒的早期诊断中提供了一个快速可行的解决方案。

本发明的第一个目的是提供用于树鼩副粘病毒PCR检测的引物。

本发明所提供的引物，是以树鼩副粘病毒血凝素基因组序列自5’端第8231-8720bp区域(序列表中SEQ ID NO：1)为对象设计的，用以检测样品中是否存在树鼩副粘病毒污染。

具体来讲，所述引物的上游引物453-F2具有序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，下游引物453-R2具有序列表中SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

本发明的第二个目的是提供用于检测树鼩副粘病毒的PCR试剂盒。

本发明所提供的试剂盒，包括上述用于对树鼩副粘病毒进行PCR检测的引物。

具体来讲，所述试剂盒包括逆转录反应试剂和PCR反应试剂：

25μl逆转录反应试剂包括：5×buffer(Promega AMV Transcriptase，catalog#M5108)5μl，dNTP(浓度2.5mM)4μl，随机引物(浓度500ug/mL)0.5μl，AMV(浓度10U/ul)0.5μl，去Rnase的dH₂O 7μl；

25μl PCR反应试剂包括：HS Taq酶(浓度5u/μl)0.15μl，10×buffer(TaKaRa Taq^TM Hot Start Version DR007A)2.5μl，dNTP(浓度2.5mM)2μl，ddH₂O 17.35μl，上游引物453-F2(浓度10μM)1μl，下游引物453-R2(浓度10μM)1μl。

为方便检测，所述试剂盒中还可包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为树鼩副粘病毒阳性质粒，所述阴性对照为不含DNA的PCR扩增体系，如双蒸水。

上述PCR引物或试剂盒在树鼩副粘病毒PCR检测中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的第三个目的是提供一种树鼩副粘病毒的PCR检测方法。

本发明所提供检测方法，可包括以下步骤：

1)提取样本RNA；

2)以样本RNA为模板逆转录合成其cDNA；

3)PCR检测：以步骤2)获得的cDNA为模板，在上述专用引物的引导下进行PCR扩增，反应结束后对PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，若能扩增出长度为453bp的目的片段，则检测结果为阳性，反之为阴性。

在上述树鼩副粘病毒的PCR检测方法中，所述步骤1)的样本是从树鼩身上分离得到的血液、粪便或肾组织。