[发明专利]一种体外诱导扩增NK细胞的方法

权利要求书

1.一种体外诱导扩增NK细胞的方法，其特征在于包括向NK细胞培养液中添加三叶青提取物，所述的三叶青提取物的浓度为0.00625μg/ml～9.76μg/ml；所述三叶青提取物为三叶青总提取物，其制备方法为取三叶青干燥药材，加5倍体积80％乙醇水溶液浸泡24h后，加热回流提取，共3次，每次40min，合并提取液，过滤，减压回收蒸干，得三叶青总提取物；

或者，

所述三叶青提取物为水煮脱糖部位Th-w3，其制备方法为：取三叶青干燥药材200g，加5倍体积80％乙醇水溶液浸泡24h后，加热回流提取，共3次，每次40min，合并提取液，除去提取液后的三叶青药材用水煮后减压回收蒸干，获得脱水物2.1克；

或者，

所述三叶青提取物为石油醚部位Th-p，取三叶青总提取物，加水混悬，采用10倍体积的水饱和石油醚进行萃取，得到石油醚部位TH-p；

或者，

所述三叶青提取物为Th-w2，其制备方法为：取三叶青干燥药材200g，加5倍体积80％乙醇水溶液浸泡24h后，加热回流提取，共3次，每次40min，合并提取液，过滤，减压回收蒸干，得总提取物TH-t 21.6g，取此总提取，加水混悬，采用10倍体积的水饱和石油醚，进行萃取，得到石油醚部位TH-p 0.15g，用乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯部位TH-a 0.58g，用正丁醇萃取得到正丁醇部位TH-b 2g，以及水部位TH-w，取水部位TH-w进行大孔吸附树脂色谱，先使用纯水进行洗脱，除去糖分，再使用10％、30％、60％、95％乙醇水溶液分别依次洗脱，其中，30％乙醇水洗脱溶液蒸干后得到水部位脱糖流分TH-w2。

2.根据权利要求1所述的体外诱导扩增NK细胞的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)单个核细胞分离：静脉穿刺采集患者外周血，转移至含肝素钠的抗凝瓶中，上下混匀，将外周血样本移至离心管进行离心，弃上层血浆，生理盐水稀释血样，淋巴分离液分离单个核细胞，生理盐水重悬单个核细胞，离心收集单个核细胞；

(2)细胞种瓶：将上述单个核细胞用含rhIL-2的NK细胞培养液稀释至细胞浓度为2×10⁵～1×10⁶/ml，接种于6孔细胞培养板中，毎孔5ml，于37℃、5％CO2培养箱培养；

(3)细胞扩增：每2天半量换液1次，并调整细胞密度为4×10⁴～6×10⁴/mL，NK细胞培养至第7天，向培养液中添加三叶青提取物，浓度为0.00625μg/ml～9.76μg/ml，此后继续培养；

(4)细胞收集：培养3至21天，收集培养的NK细胞。

3.根据权利要求2所述的体外诱导扩增NK细胞的方法，其特征在于所述步骤(2)中的rhIL-2的浓度为500U/ml。

4.根据权利要求2所述的体外诱导扩增NK细胞的方法，其特征在于所述步骤(2)中NK细胞浓度为3.5×10⁵ml。

5.根据权利要求2所述的体外诱导扩增NK细胞的方法，其特征在于所述步骤(3)中调整细胞密度为5×10⁴/ml。

6.根据权利要求1或2所述的体外诱导扩增NK细胞的方法，其特征在于所述三叶青提取物的浓度为0.01μg/ml～2.44μg/ml。