[发明专利]一种体外诱导扩增NK细胞的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及利用三叶青提取物的一种体外诱导扩增NK细胞的方法。

背景技术

近年来，肿瘤的生物治疗已经成为肿瘤治疗领域研究的热点。NK细胞是一类独立的淋巴细胞群，NK细胞主要通过细胞毒活性而显示生物学效应，可直接杀伤肿瘤细胞、病毒感染的细胞，胞内寄生菌等。NK细胞可以识别自身正常细胞和异常组织细胞，其仅杀伤异常细胞而对宿主正常组织细胞没有细胞毒作用。此外，NK细胞通过分泌多种细胞因子，在免疫调节和某些免疫细胞分化中发挥重要作用。NK细胞主要以组织相容性复合物(major histocompatibility complex，MHC)非限制性方式识别肿瘤，通过颗粒酶B(granzyme B)和穿孔素(perforin)等途径杀伤肿瘤细胞，而T细胞表面的CD107aPb分子，与T细胞活化以后脱颗粒过程相关，其比值可以直接反应该效应细胞具有的特异性杀伤活性。

同时，NK细胞还能与其它固有免疫细胞和适应性免疫细胞相互作用，协同发挥抗肿瘤作用。目前NK细胞已经成为肿瘤患者过继免疫治疗的重要效应细胞。由此可见，为满足生物学功能研究和临床过继细胞免疫治疗需要，扩增出高效和较多数量的NK细胞是许多学者共同研究的课题。

现阶段体外扩增NK细胞主要采取饲养层细胞共培养法和免疫磁珠分选法，但饲养层细胞共培养是将NK细胞添加到经改造后的肿瘤细胞株，这样改造在临床上应用的安全性没有得到保障，而免疫磁珠分选法操作过程繁琐，成本高，不适合临床大规模应用。

发明内容：

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种体外诱导扩增NK细胞的方法，可在体外培养条件下获得大量的、应用安全的、纯度较高的以及杀伤活性强的NK细胞，从而使得该细胞达到能够安全有效的应用于临床的质量指标。

为实现该发明目的，本发明采用的技术方案为：一种体外诱导扩增NK细胞的方法，包括向NK细胞培养液中添加三叶青提取物，所述的三叶青提取物的浓度为0.00625μg/ml～9.76μgg/ml。

更具体的，本发明的体外诱导扩增NK细胞的方法，包括以下步骤：

(1)单个核细胞分离：静脉穿刺采集患者外周血，转移至含肝素钠的抗凝瓶中，上下混匀，将外周血样本移至离心管进行离心，弃上层血浆，生理盐水稀释血样，淋巴分离液分离单个核细胞，生理盐水重悬单个核细胞，离心收集单个核细胞；

(2)细胞种瓶：将上述单个核细胞用含rhIL-2的NK细胞培养液稀释至NK细胞浓度为2×10⁵～1×10⁶/ml，接种于6孔细胞培养板中，毎孔5ml，于37℃、5％CO2培养箱培养；

(3)细胞扩增：每2天半量换液1次，并调整细胞密度为4×10⁴～6×10⁴/mL，NK细胞培养至第7天，向培养液中添加三叶青提取物，浓度为0.00625μg/ml～9.76μg/ml，此后继续培养；

(4)细胞收集：培养3至21天，收集培养的NK细胞。

优选的，步骤(2)中的rhIL-2的浓度为500U/ml。

优选的，步骤(2)中NK细胞浓度为3.5×10⁵ml。

优选的，步骤(3)中调整细胞密度为5×10⁴/ml。

优选的，步骤(3)中三叶青提取物的浓度为0.01μg/ml～2.44μg/ml。

优选的，所述的三叶青提取物为三叶青总提取物，其制备方法为用乙醇溶液加热回流三叶青而提取得到的。

优选的，所述的三叶青提取物为水煮脱糖部位Th-w3，其制备方法为经有机溶剂提取后的三叶青药材用水煮后减压回收蒸干。

优选的，所述的三叶青提取物为石油醚部位Th-p，取三叶青总提取物，用石油醚进行分步萃取得到。

优选的，所述的三叶青提取物为水部位脱糖部位Th-w2，其制备方法为三叶青总提取物的水部位除去糖分，用30％乙醇水洗脱溶液蒸干后得到。

本发明通过向NK细胞培养液中加入三叶青提取物扩增自然杀伤细胞的方法的在于：