[发明专利]一种水稻S5基因的功能性标记S5-n-j-i及基因分型方法

权利要求书

1.一种水稻S5基因的功能性标记S5-n-j-i，其特征在于，所述标记S5-n-j-i由6条引物S5-n-F、S5-n-R、S5-i-F、S5-j-R、S5-O-F和S5-O-R构成，其中，S5-n-F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体为：5’-TATGACCAGCACCATCTTCG-3S5-n-R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体为：5’-GAGGGACACTCCAACTCGTC-3S5-i-F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，具体为：5’-CCCTGATATTCTGAGTTACAAGGCACTC-3S5-j-R的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，具体为：5’-GGTCTCGTCAGTGGGCAAGCAGTAGTTT-3S5-O-F的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，具体为：5’-GCAAGATGGTGACAGACACGCT-3S5-O-R的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，具体为：5’-CAGTGAGTAGGTTGGCCTGTTGATT-3上述引物序列中带下划线的碱基为引入的错配碱基。

2.一种水稻S5基因的功能性标记S5-n-j-i的基因分型方法，其特征在于，利用权利要求1所述的功能性标记S5-n-j-i，具体按照以下步骤实施：

步骤1、水稻基因组DNA的提取；

步骤2、利用步骤1中提取的基因组DNA为模板，构建PCR反应体系，加入权利要求1中所述的引物进行PCR扩增；

步骤3、将PCR扩增进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测并进行基因型判定。

3.根据权利要求2所述的水稻S5基因的功能性标记S5-n-j-i的基因分型方法，其特征在于，所述步骤1中水稻基因组DNA的提取具体按照以下步骤实施：

(1)取适量新鲜叶片放在2mL离心管中加液氮捣碎，向离心管中加入1mL CTAB抽提液，摇匀；

(2)置于65℃的水浴锅或恒温箱，每隔10min轻轻摇动一次，30-45min后取出；

(3)冷却2min后，加入氯仿-异戊醇(24∶1)至满管，上下剧烈摇动，使两者混合均匀；

(4)离心管放入离心机中15,000r/min离心10min后取出；

(5)小心吸取上清液至新的灭菌离心管中，然后加入600μL预冷的异丙醇，上下轻轻摇动，使异丙醇与水层充分混合；

(6)-20℃放置20min，使DNA充分沉淀；

(7)10,000r/min瞬间离心，立即倒掉液体，再将离心管倒立于铺开的纸巾上；

(8)1min后直立离心管，加入720μL 70％的乙醇及80μL 3M NaAc溶液，轻轻摇动，用手指轻弹管尖，使DNA沉淀浮游于液体中；

(9)至少放置30min，使杂质充分溶解；

(10)10,000r/min瞬间离心，立即倒掉液体，加入800μL 70％的乙醇将DNA再次漂洗20-30min；

(11)15,000r/min离心3-5min，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；

(12)数分钟后直立离心管，通风厨内干燥DNA；

(13)加入100μL 1×TE Buffer，使DNA充分溶解；

(14)置于-20℃保存、备用。

4.根据权利要求2所述的水稻S5基因的功能性标记S5-n-j-i的基因分型方法，其特征在于，所述步骤2中特异性PCR反应体系如下：1μL的模板DNA，10μm/L的4个引物各0.3μL，7.5μL 2×Power Taq PCR Master Mix，其余由双蒸灭菌水ddH2O补足15μL。

5.根据权利要求4所述的水稻S5基因的功能性标记S5-n-j-i的基因分型方法，其特征在于，所述步骤2中的PCR反应程序为：94℃预变性5min；35个循环，每个循环为：94℃40sec，57℃40sec，72℃30sec；72℃再延伸10min。