[发明专利]一种无乳链球菌环介导等温扩增试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种无乳链球菌环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括LAMP引物、2×反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、荧光目视检测试剂、超纯水和无乳链球菌DNA模板；所述的LAMP引物包括外引物F3（SEQ ID NO：1）与B3（SEQ ID NO：2）和内引物是FIP（SEQ ID NO：3）与BIP（SEQ ID NO：4）；

其中引物的序列分别为：

F3 GTAGCAGCCCCTAGAGTG

B3  GTTGTGCTACCGGTGTTG

FIP  AGCTGATACATGCTCTGGTGATGGCAAGTGTTAAAGTAGTCACTC

BIP GTTCCTGTGACTACGACTTCAACTTTTGTGCTACCGGAAGG；

所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL、KCL、MgSO₄、(NH₄)₂SO₄、Tween20、Betaine和dNTPs。

2.根据权利要求1所述的无乳链球菌环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述的无乳链球菌DNA模板是使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取无乳链球菌培养物的基因组DNA。

3.根据权利要求1所述的无乳链球菌环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。

4.根据权利要求1所述的无乳链球菌环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL 35-55mM、KCL 18-32mM、MgSO₄ 15-25mM、(NH₄)₂SO₄ 22-28mM、Tween20 0.3-0.6℅、Betaine 1.5-3 M 和dNTPs3-4 .5mM。

5.一种无乳链球菌环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，用于检测疑似无乳链球菌，具体检测步骤包括：

（1）LAMP引物的设计与合成

（2）无乳链球菌DNA模板的提取

（3）LAMP反应体系建立

（4）LAMP检测方法。

6.根据权利要求5所述的无乳链球菌环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，所述的LAMP反应体系建立LAMP反应体系以25μl计，

2×反应缓冲液                            12.5 μL

Bst DNA聚合酶                             1 μL

FIP                                        40 pmol

BIP                                        40 pmol

F3                                          5 pmol

B3                                            5 pmol

无乳链球菌DNA                                2 μL

超纯水                                       补足25 μL。

7.根据权利要求5所述的无乳链球菌环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，所述的LAMP检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和荧光可视化检测的方法。

8.根据权利要求5所述的无乳链球菌环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，所述的LAMP检测方法采用实时浊度仪进行密闭全程监控。