[发明专利]一种无乳链球菌环介导等温扩增试剂盒及其应用

说明书

技术领域

 本发明涉及微生物检测技术领域，具体说是涉及一种快速、可视化并且可实时定量检测无乳链球菌的环介导等温扩增试剂盒及其应用。

背景技术

鱼类链球菌病是一种由链球菌感染引起的疾病，病原菌归属3个属和7个种。链球菌属的病原菌有海豚链球菌(Streptococcus iniae)、无乳链球菌(Streptococcus agalactme)、副乳房炎链球菌(Streptococcus parauberis)及停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)；乳球菌属的有格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)和鱼乳球菌(Lactococcus piscium)；漫游菌属的有鲑鱼漫游菌(Vagococcus salmoninarum)。其中，海豚链球菌、无乳链球菌、副乳房炎链球菌、停乳链球菌及格氏乳球菌为暖水鱼类链球菌病的病原菌，而鱼乳球菌和鲑鱼漫游菌属于冷水性鱼类链球菌病的病原菌。

目前发现海豚链球菌和无乳链球菌是引起多种野生鱼类和经济养殖鱼类链球菌病的最主要两种病原。其中，由无乳链球菌引起的链球菌病在全世界范围内可引发多种淡水和海水鱼类大面积感染，具有很高感染率和致死率。该菌可感染包括虹鳟鱼、海鲤、罗非鱼、黄狮鱼、鲶鱼、白花鱼、鲱鱼、鲻鱼等在内的17种鱼类。

罗非鱼链球菌病呈全球流行，每年给世界罗非鱼产业造成巨额经济损失。在中国，2001～2006年罗非鱼养殖陆续出现链球菌病，并在个别养殖场造成5～15％的累计死亡率。2009～2012连续4年，该病在中国罗非鱼主要养殖区大面积暴发流行，累计死亡率在15～95%之间，给我国罗非鱼养殖业造成的经济损失累计高达16亿美元。据调查，在中国，该病的主要病原也由2008年以前的海豚链球菌转变为2008年后的无乳链球菌。因此，如何快捷、高效、准确地诊断无乳链球菌病就显得格外重要。

目前，罗非鱼无乳链球菌的检测技术主要有常规方法和分子生物学方法。常规方法是通过对细菌的表型特征和生化指标进行鉴定。鉴定无乳链球菌的生化指标主要包括：革兰氏染色、氧化酶实验、过氧化氧酶实验、CAMP实验、V-P反应(福格斯-普利斯考尔)产物实验、凝集实验、ELISA实验；Lancefield氏群特异性抗原群鉴定等。但常规鉴定方法存在操作复杂,所需时间长以及特异性不强的缺点。目前有一些自动快速细菌鉴定系统用于链球菌鉴定,如RAPID Strep strip、API rapid strep 32、API 20E Vitek 系统、ATB 快速检测系统等，但细菌自动鉴定仪器检测无乳链球菌的结果不稳定，且由于细菌自动化鉴定的数据库中模式菌株数量有限，链球菌的关键数据尚在研究中，因此该方法的应用也受到限制。

利用基因组16SrRNA基因开发的特异性PCR方法常用于鉴定链球菌。此外,还有利用16S-23SrDNA序列、乳酸氧化酶(lctO)和 CAMP 因子等对链球菌进行快速PCR鉴定。另外，也建立了无乳链球菌的双重PCR方法和巢式PCR方法用于检测无乳链球菌。虽然PCR方法较常规方法快速准确，但需要复杂的仪器设备，成本较高，不适合基层和现场检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种为基层简便、快捷准确地检测无乳链球菌的方法，公开一种快速、实时定量的定量检测无乳链球菌的环介导等温扩增试剂盒。为实现本发明目的所使用的技术方案为：

一种无乳链球菌环介导等温扩增试剂盒，该试剂盒包括LAMP引物、2×反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、荧光目视检测试剂、超纯水和无乳链球菌DNA模板；所述的LAMP引物包括外引物F3（SEQ ID NO：1）与B3（SEQ ID NO：2）和内引物是FIP（SEQ ID NO：3）与BIP（SEQ ID NO：4）；

其中引物的序列分别为：

F3   GTAGCAGCCCCTAGAGTG

B3  GTTGTGCTACCGGTGTTG

FIP  AGCTGATACATGCTCTGGTGATGGCAAGTGTTAAAGTAGTCACTC

BIP GTTCCTGTGACTACGACTTCAACTTTTGTGCTACCGGAAGG