[发明专利]一株产乙基长春胺的夹竹桃科内生真菌CH1及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一株产乙基长春胺夹竹桃科的内生真菌CH1的培养及其代谢产物的应用。

背景技术

长春胺类生物碱，是近几年新兴的一种重要生物碱，其包含了长春胺(Vincamine)、长春西汀(vinpocetine)、长春质碱(catharanthine)、乙基长春胺(ethylvincaminate)等多种具有要药用价值生物碱。长春生物碱类具有预防和治疗缺血性心脑血管疾病及其合并症、改善视力等多种药理作用。

目前国内外主要的长春生物碱制备方法三种：植物提取、化学合成与细胞培养技术。

OniscuC等人报道了从长春花鲜草中提取脱水长春胺类生物碱的方法，该方法虽然操作过程简单，但长春碱的收率极低，工业成本较高且不能满足社会需求。

公开号为CN102164921B的发明专利介绍了用化学合成制备长春西汀和阿扑长春胺的方法，该方法原料稀缺，并产生多个终产物和副产物的混合物，从而增加了整个方法的时间和成本。

ElizabethMcCoy等通过在长春花细胞培养体系中添加不同的色氨酸衍生物获得了不同于原长春花中生物碱的新的吲哚生物碱，但是，长春花中吲哚生物碱种类多，合成代谢途径复杂，长春碱的收率极低。

本发明从夹竹桃中分离到一株产乙基长春胺夹竹桃科内生真菌，并对该菌株发酵代谢产物进行研究。该发明为产长春生物碱解决了原料稀缺的问题并提供了一种新的研究方向和思路。

发明内容

本发明的目的是针对的长春生物碱生产过程的不足，提供一种从夹竹桃中分离筛选出的产乙基长春胺内生真菌的方法。该方法反应过程温和，产率较高，能有效降低生产成本。

为了解决前述技术问题，本发明提供了一种产乙基长春胺内生真菌的方法。本发明所述的内生真菌是从夹竹桃植物活体中采用内生真菌分离纯化技术分离获得的。命名为CH1，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日：2014年12月，保藏登记号为CCTCCM2014676。

本发明所述的内生真菌的固体培养特征为：在培养基上27±2℃培养，生长较缓慢，呈辐射状，表面疏松、平坦；菌落颜色初为白色，后颜色逐渐变深最终为紫黑色，正反面颜色不同，有气生菌丝；霉味。

本发明目的通过以下技术方案来实现：

(1)菌种分离与活化：将经过预处理的植物组织在无菌条件下切成1cmx1cm小块，转接在制备好的分离培养基上，于27℃倒置培养至菌丝覆盖培养皿，待组织块周围长出菌丝后挑取尖端部分，继续接种培养。取实验室保存的夹竹桃科内生真菌菌种，在洁净工作台处操作，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的固体培养基，于27±2℃倒置培养至菌丝覆盖培养皿；培养基组成成分为；土豆：10～20％、葡萄糖：1％～5％、蔗糖1％～5％、MgSO41‰～5‰，牛肉膏1％～5％，氨基酸1‰～5‰，所述氨基酸是脯氨酸、色氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸中的一种或多种。

(2)发酵培养：取活化培养后的菌种，在无菌条件下，转接入已灭菌的液体种子培养基中，27±2℃下摇床培养，得种子发酵液；无菌条件下，按照10％的接种量接种于灭菌处理过的液体培养基中，27±2℃下间歇性震荡培养6～8天；

(3)产物处理：发酵完毕，超声处理30～45min；过滤，菌液减压蒸干至100～150ml，有机溶剂萃取，菌丝干燥后粉碎，有机溶剂萃取，合并有机相，减压浓缩可得乙基长春胺、长春西汀等长春胺类化合物。所述萃取所用的溶剂为石油醚、三氯甲烷、苯、正己烷中的一种。

本发明的有益效果：

一是本发明从夹竹桃树皮中分离筛选出一株产乙基长春胺内生真菌CH1，这为乙基长春胺等长春胺生物碱的开发提供了一种新的研究思路；

二是本发明提供了利用内生真菌发酵获得定向活性代谢产物的方法；为生产长春胺类生物碱开发增添了新的途径。

附图说明

图1本发明所述夹竹桃科内生真菌在平板培养基上的形态图。

图2本发明所述夹竹桃科内生真菌在液体培养基中的形态图。

图3本发明所述夹竹桃科内生真菌的微观形态图。

图4本发明所述内生真菌次级代谢产物中乙基长春胺与标准品HPLC比对图谱。

图5本发明所述夹竹桃科内生真菌菌丝体次级代谢产物中乙基长春胺的LC-MS图谱。

具体实施方式