[发明专利]低血清培养Vero细胞生产猪流行性腹泻CV777株病毒的方法

权利要求书

1.低血清培养Vero细胞生产猪流行性腹泻CV777株病毒的方法，其特征在于，它包括以下步骤：

S1. 制备用细胞的传代与培养：

    取T75瓶培养铺满单层Vero细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化细胞，用细胞生长液吹打分散细胞，加入20ml细胞生长液，将Vero细胞置于温度为37±2℃的二氧化碳培养箱中培养72h，待形成良好的细胞单层时，进行放大培养, 上述细胞生长液为10%血清含量的DMEM或MEM培养液；

S2. 驯化细胞适应低血清培养基：包括以下子步骤：

S21. 第一代细胞的驯化：

将步骤S1扩大培养的Vero细胞接种到第一代低血清培养基中进行驯化，所述第一代低血清培养基为含10%血清的DMEM或MEM培养液和含5%血清的默克MD低血清培养液的混合液，DMEM或MEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为2:1，其中血清的含量为8.3%；

S22. 第二代细胞的驯化：

将驯化的第一代Vero细胞接种到第二代低血清培养基中进行驯化，所述第二代低血清培养基为含10%血清的DMEM或MEM培养液和含5%血清的默克MD低血清培养液的混合液，DMEM或MEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为1:1，其中血清的含量为7.5%；

S23. 第三代细胞的驯化：

将驯化的第二代Vero细胞接种到第三代低血清培养基中进行驯化，所述第三代低血清培养基为含10%血清的DMEM或MEM培养液和含5%血清的默克MD低血清培养液的混合液，DMEM或MEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为1:2，其中血清的含量为6.7%；

S24. 第四代细胞的驯化：

将驯化的第三代Vero细胞接种到第四代低血清培养基中进行驯化，所述第四代低血清培养基为默克MD低血清培养基和血清的混合液，血清的含量为5%；

S3. 驯化细胞适应低血清培养环境：

    使用T75细胞瓶，37℃静态培养驯化的第四代Vero细胞，培养液为默克MD低血清培养基和血清的混合液，血清的含量为1～5%，即为生产用种子细胞；

S4. 细胞毒种的繁殖：

    用病毒培养液将猪流行性腹泻CV777株病毒毒种按1～5%（v/v）的比例接种到生产用种子细胞单层中进行培养，至细胞70%发生病变时收获毒液；将此毒液作为种毒，在生产用细胞上进行细胞适应性连续传代，直至TCID₅₀稳定，此时收获的毒液作为生产用种毒；

S5. 制备毒液的繁殖：

    待生产用种子细胞形成单层，按1～5%（v/v）的比例接入生产用种毒，置于培养温度为37±2℃的二氧化碳培养箱中培养，待70%以上细胞发生病变时收获病毒液。

2.如权利要求1所述的低血清培养Vero细胞生产猪流行性腹泻CV777株病毒的方法，其特征在于，所述EDTA-胰酶细胞分散液为质量分数为0.10～0.25%的胰酶和0.02%的EDTA的Hank’s液的混合液。

3.如权利要求1所述的低血清培养Vero细胞生产猪流行性腹泻CV777株病毒的方法，其特征在于，步骤S1中所述细胞生长液为低血清培养基和血清的混合液，其中血清的含量为1～5%。

4.如权利要求1所述的低血清培养Vero细胞生产猪流行性腹泻CV777株病毒的方法，其特征在于，步骤S4和S5中所述的病毒毒种培养液为低血清培养基、血清和抗生素的混合液，其中，血清的含量为0～1%，抗菌素的含量为100～200IU/mL，且混合液的pH值为7.2～7.4。