[发明专利]低血清培养Vero细胞生产猪流行性腹泻CV777株病毒的方法

说明书

技术领域

本发明属于兽医生物学技术领域，具体涉及低血清培养Vero细胞生产猪流行性腹泻CV777株病毒的方法。

背景技术

2010年下半年以来，猪流行性腹泻病又在我国出现新一轮的爆发流行。最早发生在广西，然后湖南、华北、华东、山东、河北等地普遍发病，呈现全国性大流行，造成哺乳猪仔的大量死亡，据农业部流行病学中心统计，2011年猪流行性腹泻(PED)病引起猪的死亡数已占据所有我国现有猪病的首位。

目前，国内猪流行性腹泻疫苗生产技术不论是传统的转瓶培养技术，还是先进的生物反应器悬浮培养技术，均采用高血清含量细胞培养技术。该传统工艺效率低、生产成本高；不同血清批次间差异显著；放大重现性较差；对下游纯化工艺要求高；容易出现血清出复杂成分导致的疫苗质量隐患，涉及生物安全和公共卫生问题。另外，目前全球血清供应趋紧，这大大影响了疫苗企业的生产效率。因此低血清培养技术的应用势在必行。经检索，未有关于低血清培养Vero细胞生产猪流行性腹泻CV777株病毒的相关文献报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供低血清培养Vero细胞生产猪流行性腹泻CV777株病毒的方法，该方法可以显著降低生产成本，同时可以提高下游纯化的效率，并且能够快速稳定的扩大生产规模，质量易于实现均衡稳定。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：低血清培养Vero细胞生产猪流行性腹泻CV777株病毒的方法，它包括以下步骤：

S1.制备用细胞的传代与培养：

取T75瓶培养铺满单层Vero细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化细胞，用细胞生长液吹打分散细胞，加入20ml细胞生长液，将Vero细胞置于温度为37±2℃的二氧化碳培养箱中培养72h，待形成良好的细胞单层时，进行放大培养,上述细胞生长液为10％血清含量的DMEM或MEM培养液；

S2.驯化细胞适应低血清培养基：包括以下子步骤：

S21.第一代细胞的驯化：

将步骤S1扩大培养的Vero细胞接种到第一代低血清培养基中进行驯化，所述第一代低血清培养基为含10％血清的DMEM或MEM培养液和含5％血清的默克MD低血清培养液的混合液，DMEM或MEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为2:1，其中血清的含量为8.3％；

S22.第二代细胞的驯化：

将驯化的第一代Vero细胞接种到第二代低血清培养基中进行驯化，所述第二代低血清培养基为含10％血清的DMEM或MEM培养液和含5％血清的默克MD低血清培养液的混合液，DMEM或MEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为1:1，其中血清的含量为7.5％；

S23.第三代细胞的驯化：

将驯化的第二代Vero细胞接种到第三代低血清培养基中进行驯化，所述第三代低血清培养基为含10％血清的DMEM或MEM培养液和含5％血清的默克MD低血清培养液的混合液，DMEM或MEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为1:2，其中血清的含量为6.7％；

S24.第四代细胞的驯化：

将驯化的第三代Vero细胞接种到第四代低血清培养基中进行驯化，所述第四代低血清培养基为默克MD低血清培养基和血清的混合液，血清的含量为5％；

S3.驯化细胞适应低血清培养环境：

使用T75细胞瓶，37℃静态培养驯化的第四代Vero细胞，培养液为默克MD低血清培养基和血清的混合液，血清的含量为1～5％，即为生产用种子细胞；

S4.细胞毒种的繁殖：

用病毒培养液将猪流行性腹泻CV777株病毒毒种按1～5％(v/v)的比例接种到生产用种子细胞单层中进行培养，至细胞70％发生病变时收获毒液；将此毒液作为种毒，在生产用细胞上进行细胞适应性连续传代，直至TCID₅₀稳定，此时收获的毒液作为生产用种毒；

S5.制备毒液的繁殖：

待生产用种子细胞形成单层，按1～5％(v/v)的比例接入生产用种毒，置于培养温度为37±2℃的二氧化碳培养箱中培养，待70％以上细胞发生病变时收获病毒液。

进一步地，所述EDTA-胰酶细胞分散液为质量分数为0.10～0.25％的胰酶和0.02％的EDTA的Hank’s液的混合液。

进一步地，步骤S1中所述细胞生长液为低血清培养基和血清的混合液，其中血清的含量为1～5％。