[发明专利]乳腺癌前哨淋巴结示踪剂吲哚菁绿-利妥昔单抗的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种乳腺癌前哨淋巴结的特异性示踪剂吲哚菁绿-利妥昔单抗的制备方法。

背景技术

前哨淋巴结是乳腺癌转移的第一站淋巴结，其病理情况对乳腺癌外科手术方式及术后综合治疗有重要的指导价值。前哨淋巴结活检是乳腺癌淋巴结分期的技术手段，准确定位前哨淋巴结是乳腺癌前哨淋巴结活检研究一直关注的技术领域。前哨淋巴结定位的传统示踪剂包括染料、核素、荧光等，这些均为非特异性示踪剂。其中染料法(美兰、专利蓝和纳米碳)定位前哨淋巴结主要是通过术前在乳腺原发肿瘤周围和(或)皮下注射染料后，然后于腋窝区域循着被染料染色的淋巴管精细解剖找到第一枚被染色的淋巴结，从而确定前哨淋巴结的具体位置，然而这种方法需要精湛的外科解剖技巧，并且经过学习曲线后仍存在较高的前哨淋巴结活检假阴性率，这导致前哨淋巴结活检的准确性难以把握；而核素法(^99mTc-硫胶体)定位前哨淋巴结是通过术前于乳腺原发肿瘤周围腺体和(或)皮下注射放射性核素后，术中利用γ探测仪探测放射性计数，依据放射性计数找到计数较高的淋巴结，从而确定前哨淋巴结(大于最高放射性计数10％的淋巴结)的具体位置，虽然该方法前哨淋巴结活检的准确率高、特异性好，但是在实际操作时存在放射性核素污染及医务人员放射性损害的问题，而且其中的硫胶体并没有通过中国食品药品监督管理局的批准，限制了其在临床实际工作中的推广使用；荧光法(吲哚菁绿)定位前哨淋巴结的方法与染料法相似，主要是通过术前在乳腺原发肿瘤周围和(或)皮下注射荧光示踪剂后，术中利用近红外荧光显像仪循荧光显像发亮的淋巴管找到第一枚荧光显像阳性的淋巴结，从而定位前哨淋巴结的具体位置，然而由于荧光示踪剂分子需要近红外光源激发，其被激发所释放出荧光的穿透力只有9mm左右，所以活检过程中很难发现位置较深的淋巴管，从而导致前哨淋巴结的漏检，而位置较浅的淋巴管虽然可以清晰地发现荧光显像但在离断后其内的荧光示踪剂随淋巴液一起漏出，极易造成淋巴管周围组织荧光示踪剂显像污染，导致难以辨识淋巴管的位置，最终造成前哨淋巴结漏检，这也不是理想的前哨淋巴结示踪剂。另外，目前特异性的前哨淋巴结显像剂^99mTc-利妥昔单抗的制备工艺较复杂，需经过抗体修饰、修饰后分离、抗体分装、抗体标记以及分离纯化等等步骤，而且在制备、使用等过程中相关人员不可避免的会直接接触到放射性物质，因此极易造成实验技师、外科医生、病理科医生等相关人员的放射性损伤，另外该方法制备的利妥昔单抗与放射性核素的标记率有时仅为90％，难以满足前哨淋巴结显像和定位的要求，容易导致显像不准确情况的出现。

吲哚菁绿是乳腺癌前哨淋巴结活检的传统荧光示踪剂，可以被荧光脉管系统成像仪(MDM-I型荧光脉管系统成像仪,廊坊明德生物医药技术有限公司)前的近红外光源(760nm)激发产生荧光(820-830nm)，所产生的荧光可以穿透人体组织，利用成像仪可清晰直观地观察到淋巴管的引流途径和前哨淋巴结的显像位置，但是其在前哨淋巴结活检方面的显像率高、敏感性高和准确性低，极易导致前哨淋巴结以外的次级淋巴结显像。

目前存在利妥昔单抗与吲哚菁绿结合的制备方法并无详细操作步骤和具体配备剂量的说明。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种乳腺癌前哨淋巴结特异性示踪剂吲哚菁绿-利妥昔单抗的制备方法，该制备方法简单、安全，制得的吲哚菁绿-利妥昔单抗能满足前哨淋巴结特异性显像和精确定位的要求。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

乳腺癌前哨淋巴结特异性示踪剂吲哚菁绿-利妥昔单抗的制备方法，包括以下步骤：

在室温条件下，将利妥昔单抗溶液和吲哚菁绿溶液迅速振荡混匀反应；然后移入用半透膜制成的透析袋中，在室温避光条件下浸入灭菌注射用水的透析液中进行透析，连续透析至无吲哚菁绿浸入透析液，收集透析袋中的利妥昔单抗与吲哚菁绿的偶联物，制成吲哚菁绿-利妥昔单抗结合的新型示踪剂。

具体包括以下步骤：

(1)分别配制利妥昔单抗溶液和吲哚菁绿溶液；

(2)将吲哚菁绿溶液缓慢滴入利妥昔单抗溶液中，此时形成混合溶液，在室温下迅速振荡混匀反应，从而使大分子利妥昔单抗与小分子吲哚菁绿进行充分的偶联反应；

(3)偶联反应后将装有偶联反应物的离心管进行离心沉淀，观察有无沉淀生成，若有沉淀生成，则去除离心管底部的沉淀后，取上清液置于半透膜制成的透析袋中；若无沉淀生成，则直接将混合液置于半透膜制成的透析袋中；