[发明专利]一种定点切割RNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种定点切割RNA的方法，属于RNA切割技术领域。

背景技术

核糖核酸，简称RNA，存在于一切细胞的细胞质和细胞核中，也存在 于大多数已知的植物病毒和部分动物病毒以及一些噬菌体中。它是由核苷 酸通过3′-5′-磷酸二酯键连接而成的多聚体。不同种类的RNA链长不同， 它们参与蛋白质的生物合成，传递遗传信息，调控生命活动，行使着各式 各样的生物功能，具有重要的生命意义。RNA可因剪切等其它生物化学作 用被破坏，其生物功能就会降低或丧失；RNA的定点剪切也可以用于制备 所需小分子的RNA。因此，RNA的特异性剪切在分子生物学，生物化学和医 学领域有着广泛的应用。例如，在RNA序列上的特定位点进行切割，可研 究切割后产物同原始RNA的功能的区别，从而进一步解析RNA序列信息， 对分子生物学的发展和生命活动的研究具有重要的意义。因此，生命科学 的研究和分子生物学的发展必须依赖于RNA特异性剪切技术。目前为止RNA 的特异性剪切主要依赖以下三种技术：Ribozyme、DNAzyme及金属离子配 合物剪切RNA。但这三种技术方案中Ribozyme所用的试剂成本较高； DNAzyme只能切割特殊的碱基序列，应用范围小；而金属离子配合物剪切 RNA对剪切环境的要求较高。因此，为解决以上问题，亟待研发一种新的 定点切割RNA的方法。

发明内容

(一)要解决的技术问题

为解决上述问题，本发明提出了一种定点切割RNA的方法，试剂成本 低，合成方法简便，应用范围广。

(二)技术方案

本发明的定点切割RNA的方法，所述方法包括如下步骤：

步骤一：设计与目的RNA互补的DNA序列，并且根据实际应用需要在 特定位置对其进行偶氮苯修饰；

步骤二：按照步骤一设计要求，合成具有偶氮苯修饰的DNA序列；

步骤三：引入RNaseH，并使其在偶氮苯修饰的DNA序列的引导下， 在指定区域或特异位点切割RNA。

进一步地，所述步骤一具体如下：设计同底物RNA互补的DNA序列， 根据底物RNA分子的大小和需要特异性剪切的位置来确定互补DNA的长短 和需要进行偶氮苯修饰的碱基；同时根据需要，进行不同程度的偶氮苯修 饰，剪切的位点由偶氮苯分子参入DNA序列的位置和数量来决定。

进一步地，所述步骤二具体如下：按照步骤一设计的DNA序列，在DNA 合成仪上合成所需要的偶氮苯修饰DNA序列，在需要的参入偶氮苯分子的 位置使用负载有偶氮苯的连接臂分子单体，将偶氮苯分子引入到碱基之间。

进一步地，所述步骤三具体如下：在步骤二合成修饰DNA结束以后， 可以用合成的修饰序列引导RNaseH对底物RNA进行特异性剪切。

作为优选的实施方案，所述连接臂分子单体为D-苏氨醇、L-苏氨醇、 1，3-丙二醇、甘油酸中的一种。

(三)有益效果

与现有技术相比，本发明的定点切割RNA的方法，本方法所使用的偶 氮苯修饰DNA序列和RNaseH在催化体系和保存条件下更加稳定，不易受 到核糖核酸酶的作用而发生降解。并且本方法所使用的试剂成本更加低廉， 反应不需要高浓度的Mg²⁺，对催化环境改变的耐受性更强；偶氮苯修饰的 DNA序列对底物RNA的切割没有碱基偏好性，应用范围广；本发明中所使 用的偶氮苯修饰DNA序列，合成方法更为简洁，在需要参入偶氮苯分子的 位置，只要使用一种负载有偶氮苯的连接臂分子便可以达到目的，并且可 以使用多种连接臂引入偶氮苯，且不影响切割的特异性和效果，合成方法 比氧甲基化修饰的DNA序列有更多的选择；本方法所使用的试剂稳定性更 高，并且设计和合成过程简单，价格低廉，并且切割不受序列的限制，任 何RNA序列都可以用本方法切割；RNaseH本身为蛋白质，其对体系温度、 pH和离子强度改变的耐受性更强；同时催化能力更高，短时间之内对底物 的降解就可以达到90％以上。此外，商业化的RNaseH和偶氮苯修饰的DNA 在标准条件下均可以保存1～2年的时间，可使用的次数多。

附图说明

图1是本发明的偶氮苯修饰的结构示意图；

图2是本发明的单一位点的RNA剪切的结构示意图；

图3是本发明的长链RNA上某一特定区域的切割的结构示意图；