[发明专利]一种猪胎儿成纤维细胞的单细胞培养方法

说明书

本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种猪胎儿成纤维细胞的单细胞培养方法。该单细胞培养方法，包括：步骤A：获得成纤维细胞悬液和饲养层细胞；步骤B：将饲养层细胞以微滴形式接种至培养皿，培养至饲养层细胞密度在微滴内100％汇合，获得饲养层细胞微滴；步骤C：将成纤维细胞悬液接种至具有饲养层细胞微滴的培养皿，经细胞培养，获得单细胞克隆。本发明提供的单细胞培养方法获得的克隆细胞基因组完全一致，有利于提高转基因猪的特异性，有利于转基因猪克隆效率的评价，以及特定均一转基因猪品系的建立。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种猪胎儿成纤维细胞的单细胞培养方法。

背景技术

中国是世界上养猪规模最大的国家，但猪生产水平远低于欧美养猪发达国家。短期内传统的育种手段很难在猪生产性能方面取得大的进展，但是转基因技术打破了远缘有性杂交的束缚，实现了不同物种生物体之间的基因交流，从而可以最大限度的利用和创造遗传变异，改良家畜的性状，创造新的家畜品种转基因动物为猪遗传育种提供了新的技术手段，可大大加速遗传改良的速度，尤其是转基因体细胞核移植技术的出现，为转基因技术在猪改良育种中的应用提供了技术支撑。

猪胎儿成纤维细胞是猪体细胞转基因克隆的重要工具细胞，目前用于猪转基因克隆的胎儿成纤维细胞是原代培养分离的混合胎儿体细胞系。在该混合细胞系中基因组中通过转染随机插入带有筛选标记的外源基因，经过加压筛选获得具有唯一筛选标记的转基因混合细胞。

但是，采用上述混合细胞系经加压筛选获得的细胞具有一定的缺陷：一方面由于加压筛选只能得到具有筛选标记的细胞，与其基因组的均一性无关，再将这些经过随机重组的混合细胞分别通过体细胞核移植技术转入受体卵细胞中进行个体激活发育，得到的个体将是具有不同重组位点的转基因猪。另一方面定点转基因的脱靶效应会导致即使基因组完全一致的细胞，产生多种转基因的可能，而这种混合细胞的体细胞克隆产生的后代将严重不均一，可能有这样或者那样的表型，甚至达不到转基因的效果，没有任何新表型。

因此，建立一种有效的胎儿成纤维细胞单细胞培养技术将有利于提高转基因猪的特异性，有利于转基因猪克隆效率的评价，以及特定均一转基因猪品系的建立。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种成纤维细胞的单细胞培养方法。该单细胞培养方法获得的克隆细胞基因组完全一致，有利于提高转基因猪的特异性，有利于转基因猪克隆效率的评价，以及特定均一转基因猪品系的建立；本发明提供的单细胞培养方法获得的克隆细胞无需进行加压筛选，因此，可简化转基因动物的生产工作。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种成纤维细胞的单细胞培养方法，包括如下步骤：

步骤A：获得成纤维细胞悬液和饲养层细胞；

步骤B：将饲养层细胞以微滴形式接种至培养皿，培养至饲养层细胞密度在微滴内100％汇合，获得饲养层细胞微滴；

步骤C：将成纤维细胞悬液接种至具有饲养层细胞微滴的培养皿，经细胞培养，获得单细胞克隆。

在本发明中，由于饲养层细胞微滴既能够提供细胞因子，又占用少量培养皿面积，达到了既能给成纤维细胞提供生长所需的良好培养环境，又能保证有足够的空间供成纤维细胞增殖形成独立的优质细胞克隆的目的，从而有利于单细胞克隆的获得，可用于均一、无筛选标记的转基因动物的生产。

作为优选，成纤维细胞悬液的细胞浓度为5～10个/mL。

作为优选，成纤维细胞悬液的接种量为10～15mL/皿。

在本发明提供的一些实施例中，步骤C中细胞培养为38℃、5％CO2恒温培养8～11天。

作为优选，饲养层细胞的接种量为300～500μL/微滴。