[发明专利]牛乳中分离凝血酶抑制肽的方法及其活性测定和质谱鉴定

说明书

本发明公开了一种牛乳中分离凝血酶抑制肽的方法及其活性测定和质谱鉴定，通过对牛乳进行酶解、纯化，对获得的蛋白组分进行抗凝血效果分析，对高抗凝血组分进行液相色谱‑电喷雾质谱鉴定和生物信息学分析，有效地分离出了牛乳中的凝血酶抑制肽，其凝血酶抑制率可达91.51％，发现了安全、毒副作用小的抗血液凝集肽，为用以制备治疗和预防血栓的药品或保健品、保障人类健康、预防和减少心血管疾病的发生提供基础。

技术领域

本发明属生命医学领域，具体涉及一种牛乳中分离凝血酶抑制肽的方法及其活性测定和质谱鉴定。

背景技术

随着我国居民生活方式的变化、人口老龄化以及城镇化的发展，心血管病发病人数持续增加，目前已成为我国发病率、致残率和死亡率最高的疾病。相应地，因心血管病造成的死亡也已占我国城乡居民总死亡原因的首位，其中农村为38.7％，城市为41.1％。病理性血栓是其中严重影响我国居民身体健康的一类心血管疾病，可引发肺梗塞、脑血栓、视网膜动静脉阻塞、心肌梗塞、四肢及周围血管栓塞，己经成为我国高致病、高死亡的一类疾病，调查显示，近年来每1000人中就有1-3人患有血栓类疾病。

研发抗凝血药物，对于预防和减少血栓类疾病具有重要的意义和临床价值。尽管肝素、口服香豆素、链激酶和尿激酶等抗凝血药物已经应用一段时间，但这些药物会导致血小板减少、出血等副作用。近些年来，从水蛭、蜱虫、钩口线虫、蛇毒和蜂毒中提取的抗凝溶栓活性物质显示出良好的抗凝血效果，但毒副作用大、来源有限、价格昂贵。随着对保健食品、功能性食品研究的不断深入，研发安全、有效、副作用小、来源广泛的抗凝血产品引起了越来越多的关注。

生物活性肽因其安全性高、易吸收、功效好，近些年来已被广泛应用于功能性产品的开发，例如抗氧化肽、降血压肽、抗疲劳肽、增强免疫力肽及增强记忆力肽。乳中含有大量的生物活性因子，如阿片样肽(Opioid peptides)、降血压肽(Antihypertensivepeptides)、抗血栓肽(Antithrombolic peptides)、免疫促进肽((Immunositimulatingpeptodes)、促钙吸收的酪蛋白磷酸肽(Casein phosphopeptides)等，这些活性多肽主要是由生物体分泌细胞、内分泌腺组织器官、体液或胞质产生或获得的，生命活动中的血液凝固或抗凝、细胞分化、神经激素递质调节、肿瘤病变、免疫调节、生物钟节律、生殖控制等均与活性多肽密切相关。

目前，一些肽类化合物已被发现具有显著的抗凝血活性，按其来源不同可分为非食物源肽和食物源肽两大类，其中非食物源抗凝肽已有较长的研究历史，而食物源抗凝肽的研究近年来才引起广泛的关注。牛乳凝固与血液凝固机制有着许多相似之处，牛乳除本身存在的抗凝结因子之外，一些隐藏在蛋白质中的肽段，经酶消化释放出来，也表现出抗凝活性，这些活性肽对血液同样具有良好的抗凝结功效，因而具有抗血栓的生理功能。牛乳作为食物的组成部分，从中提取的抗凝血肽具有副作用小、可直接使用的优势。我国是世界畜牧业大国，2012年奶牛存栏数已达1493万头，牛乳生产总量达3743.6万吨，成为世界第三大产奶国，原料来源十分丰富，具有很高的研究价值。目前，国内外在这一方面的研究还尚未见分离鉴定的报道，亟待深入研究。

经检索，付莉等采用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶对牛乳蛋白进行水解，结果水解度在5.24％-10.58％之间，其中胰蛋白酶的水解度最高；该作者上述酶采用的pH值分别为5.88、5.91、6.00、6.32、6.40和6.67，明显偏酸性；另外该作者采用鲜牛乳进行试验，其技术方案不便于技术推广和产业化进展，同时还会造成大量的经济成本。

发明内容