[发明专利]一种高灵敏度菊花B病毒的检测引物、方法及应用

权利要求书

1.一种高灵敏度菊花B病毒的检测引物，其特征在于：该引物为CVB₁-F，CVB₁-R；CVB₂-F，CVB₂-R；

其中，CVB₁-F序列为：AGTCACAATGCCTCCCAAAC，

CVB₁-R序列为：CATACCTTTCTTAGAGTGCTATGCT；

CVB₂-F序列为：TCTGAAGGTGAGCCAAGCG，

CVB₂-R序列为：CATATCCTCGGAAGTAGCCATG。

2.一种高灵敏度菊花B病毒检测方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(1)设计针对菊花B病毒的两轮特异性引物：

CVB₁-F序列为：AGTCACAATGCCTCCCAAAC，

CVB₁-R序列为：CATACCTTTCTTAGAGTGCTATGCT；

CVB₂-F序列为：TCTGAAGGTGAGCCAAGCG，

CVB₂-R序列为：CATATCCTCGGAAGTAGCCATG；

(2)以CVB₁-R为引物对待检测菊花DNA进行反转录，得到cDNA，并以步骤(1)所述两轮特异性引物进行巢式PCR扩增；

(3)将步骤(2)进行的第二轮PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，当获得381bp特异性片段时，表示待检测菊花感染菊花B病毒即CVB。

3.权利要求2所述的高灵敏度菊花B病毒检测方法，其特征在于：步骤(2)的RT-PCR反应体系，其中，第一轮PCR25μl体系为：

0.2μlTaq酶；

17.5μlddH₂O。

以第一轮产物为第二轮反应物，第二轮PCR25μl体系为：

0.2μlTaq酶；

17.5μlddH₂O。

4.权利要求2所述的高灵敏度菊花B病毒检测方法，其特征在于，步骤(2)所述RT-PCR反应程序设定为：

第一轮94℃预变性3min，94℃变性30s，53℃退火45s，72℃延伸40s，循环35次，72℃延伸7min；

第二轮94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸40s，循环35次，72℃延伸7min。

5.权利要求2-4任一项所述的高灵敏度菊花B病毒检测方法，其特征在于：以1μlcDNA模板加入25μl反应体系计量，需要cDNA模板稀释度≤10^-9，即灵敏度≤10^-9ug/ul。

6.一种检测菊花B病毒的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括权利要求1所述的引物，CVB₁-F，CVB₁-R；CVB₂-F，CVB₂-R。

7.权利要求1所述的引物在检测菊花B病毒上的应用。