[发明专利]一种高灵敏度菊花B病毒的检测引物、方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学的病毒检测领域，涉及一种高灵敏度检测菊花B病毒的引物、利用该特异引物提高菊花B病毒检测灵敏度的方法及引物对的应用。

背景技术

菊花(Chrysanthemum morifolium)为菊科菊属多年生宿根草本植物，是我国十大传统名花，也是世界上的四大切花之一。是世界上最早栽培的观赏植物之一，具有很高的经济和观赏价值。菊花通常采用无性繁殖方式，因此在种植过程中极易感染病毒，出现花叶、斑驳、畸形、矮化等症状，导致菊花种性退化，产量和质量下降，严重影响种植者效益。菊花B病毒(Chrysanthemum virus B，CVB)，隶属于麝香石竹潜隐花叶病毒属，是正义单链的RNA病毒，其基因组具有6个ORF，编码6个蛋白，全长约8-9Kb，3′端具有一个Poly-(A)结构。其病毒粒子为略微弯曲的线状，大小为685×12nm。菊花B病毒主要通过汁液和几种嫁虫以非持久性方式传播，侵染菊科植物，是危害菊花最严重的病毒之一，广泛分布于世界栽培菊花的国家和地区。菊花感染CVB后，有的叶片出现轻度斑驳，有的叶脉透明，甚至出现严重的叶斑症状和花朵畸形症状，大大降低了菊花产品的合格率，对菊花产业构成严重威胁，因此对病毒的防控是各大菊花企业尤为关心的难题，而准确可靠的菊花病毒检测方法是成功防控病毒病毒前提。

目前广泛采用的是聚合酶链式(PCR)检测方法来检测病毒，但在检测的灵敏度上还没有达到很高的效果。吴红芝(2002)发表的《RT-PCR检测菊花B病毒的研究》中检测CVB的灵敏度达到了10^-4；黄丛林(2008)申请的中国专利《一种用于检测菊花B病毒的方法》(CN200810240415)环介导等温扩增反应(LAMP)检测菊花B病毒，其灵敏度只达到了10^-3，且采用LAMP进行检测容易受到污染，出现假阳性结果，对引物设计的要求非常高；颜琛娜(2009)发表的《两重RT-PCR同步检测菊花B病毒和番茄不孕病毒》中检测菊花B病毒的灵敏度也只达到了10^-3；尤燕平(2011)申请的中国专利《一种菊花CVB和CChmvd病毒的二重RT-PCR检测方法》(201110203309.7)中检测菊花B病毒，其灵敏度也只达到了10^-3。这些都不能满足菊花B病毒在感染早期，浓度较低时的有效检测，不能及时用于田间早期的菊花病毒病防控，因而在生产实践中防控意义有限。

发明内容

本发明提供一种菊花B病毒快速检测引物及用该引物进行检测的方法，以解决现有技术中菊花B病毒的检测灵敏度不高，易出现假阳性等问题，达到菊花B病毒早期检测防控的目的。

1、本发明提供一种高灵敏度菊花B病毒的检测引物，该引物为CVB₁-F，CVB₁-R；CVB₂-F，CVB₂-R；

其中，CVB₁-F序列为：AGTCACAATGCCTCCCAAAC，

CVB₁-R序列为：CATACCTTTCTTAGAGTGCTATGCT；

CVB₂-F序列为：TCTGAAGGTGAGCCAAGCG，

CVB₂-R序列为：CATATCCTCGGAAGTAGCCATG；

2、本发明还提供一种高灵敏度菊花B病毒的检测方法，该方法包括如下步骤：

(1)设计针对菊花B病毒的两轮特异性引物：

CVB₁-F序列为：AGTCACAATGCCTCCCAAAC，

CVB₁-R序列为：CATACCTTTCTTAGAGTGCTATGCT；

CVB₂-F序列为：TCTGAAGGTGAGCCAAGCG，

CVB₂-R序列为：CATATCCTCGGAAGTAGCCATG；

(2)以CVB₁-R为引物，对待检测菊花DNA进行反转录，得到cDNA，并以步骤(1)所述两轮特异性引物进行巢式PCR扩增RT-PCR；

(3)将步骤(2)进行的第二轮PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，当获得381bp特异性片段时，表示待检测菊花感染菊花B病毒即CVB。

3、上述2提供的高灵敏度菊花B病毒检测方法，步骤(2)的RT-PCR反应体系，其中，第一轮PCR25μl体系为：