[发明专利]表达精氨酸脱亚胺酶基因的重组大肠杆菌及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种精氨酸脱亚胺酶基因、表达该基因的重组大肠杆菌，本发明还涉及该重组大肠杆菌在生产L-瓜氨酸中的应用以及一种生产L-瓜氨酸的方法。

背景技术

L-瓜氨酸具有保护肝脏、松弛血管，治疗性功能障碍，提高脑力等多种功能，近年来在食品、药物等领域越来越来受到重视，具有广泛的开发应用前景。目前L-瓜氨酸的生产方法主要有植物提取法，化学合成法、发酵法及酶转化法。其中植物提取法含量低且提取成本高，不适合大规模生产；化学有机合成法环境污染大且可能会残留毒性物质，存在着潜在的安全风险；发酵法产物浓度较低。相比之下，酶转化法具有专一性强，产物浓度高，生产周期短，成本低等特点。

精氨酸脱亚胺酶(ADI)存在于很多种微生物中，例如在细菌、支原体、单细胞绿藻、酵母等细胞中都有发现。某些微生物中得到的ADI是氨基酸降解酶，能够催化精氨酸转变成瓜氨酸和氨。目前酶法生产L-瓜氨酸多采用粪链球菌、产气荚膜梭菌、酿脓球菌、绿脓杆菌等产精氨酸脱亚胺酶，再用该酶转化精氨酸成L-瓜氨酸。

随着分子生物学的发展，应用基因工程菌取代野生菌种进行精氨酸脱亚胺酶的生物合成，具有生产周期短，积累量大，体系内杂质种类少，反应效率高、专一性强等特点。

CN 104212753A公开了一种精氨酸脱亚胺酶基因工程菌的构建及其用途，其精氨酸脱亚胺酶基因来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。将获得的大肠杆菌基因工程菌经发酵培养后转入精氨酸浓度为10％的醋酸盐缓冲液中，可以得到99.4g/L的L-瓜氨酸。该发明存在以下缺点：该大肠杆菌基因工程菌的酶活性较低，导致转化精氨酸时所需要的湿菌体用量较高(需加入1％的湿菌体)，转化时间较长(转化10％的精氨酸底物需要4h)；酶的耐温能力差(转化温度只能控制37℃左右)；需在醋酸盐缓冲液体系下进行转化，不利于后期分离纯化。

发明内容

本发明的第一个目的是针对上述缺陷，提供一种新的精氨酸脱亚胺酶基因，使表达该基因的重组大肠杆菌具有更高的精氨酸脱亚胺酶活性。

本发明的第二个目的是提供一种重组大肠杆菌。

本发明的第三个目的是提供所述重组大肠杆菌在生产L-瓜氨酸中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种L-瓜氨酸的生产方法。

上述目的是通过以下技术方案实现的：

首先，以从土壤中获得的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)为出发菌株，通过N+离子束诱变进行育种，筛选得到一株高产精氨酸脱亚胺酶的蜡样芽孢杆菌突变株93-11，该菌株已于2015年01月20日保藏于位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2015047。该菌株已另行申请了专利。

所得到的蜡样芽孢杆菌突变株具有较高的精氨酸脱亚胺基酶活性，它能将98％以上的精氨酸转化为L-瓜氨酸，而现有技术中的产酶菌株只能将80％以上的精氨酸转化成L-瓜氨酸。

抽提该突变菌株基因组DNA，并设计带有酶切位点的引物，通过PCR扩增精氨酸脱亚胺酶基因，将目的基因克隆至载体，转化宿主细胞，得到表达所述精氨酸脱亚胺酶基因的重组大肠杆菌(Escherichia coli)DH5αI2-3。该重组大肠杆菌菌株已于2015年01月20日保藏在位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2015048。

该重组大肠杆菌具有更强的精氨酸脱亚胺酶活性，用它生产L-瓜氨酸，能够大幅减少菌体的用量，缩短转化的时间，提高转化率。

最后，本发明提供了一种L-瓜氨酸的生产方法，它包括以下步骤：

1)将保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2015048的重组大肠杆菌DH5αI2-3经种子培养和发酵培养后，离心得到含精氨酸脱亚胺酶的湿菌体；

2)将步骤1)得到的湿菌体加入到精氨酸水溶液中，调节混合溶液pH为6-7，在37-60℃条件下反应0.5-4小时；

3)从反应液中分离纯化L-瓜氨酸。

优选地，步骤2)中所述混合溶液中精氨酸的浓度为10-300g/L，湿菌体的浓度为0.5-5g/L。在该条件下，精氨酸的转化率更高，转化时间更短。

优选地，所述分离纯化L-瓜氨酸的方法包括以下步骤：

1)微滤：将反应液通过孔径为0.02-1μm的陶瓷微滤膜，得到微滤透析液；