[发明专利]由XY ES细胞制备能育的XY雌性动物

说明书

描述了用于由XY供体细胞和合适的宿主胚胎制备表型雌性的能育动物的方法和组合物。提供了用于将XY供体细胞维持在培养中的培养基和方法，在引入宿主胚胎内和在合适的宿主中孕育后，所述XY供体细胞将导致能育的XY雌性动物。描述了用于由供体XY细胞和宿主胚胎在F0代中制备能育的雌性动物的方法和组合物，以及用于由杂合的F0能育雄性和杂合的F0能育雌性同胞制备F1后代的方法，所述F1后代对于修饰是纯合的。

本申请是申请号为201180028717.1的中国专利申请的分案申请。

发明领域

本发明涉及衍生自XY胚胎干(“ES”)细胞且具有XY核型的能育的雌性动物的制造。在特定实施方案中，描述了关于由XY供体鼠ES细胞制备能育的XY雌性小鼠的方法和组合物。还描述了用于支持表型雌性形成的体外受精方法。

发明背景

几乎所有通常采用的用于制备遗传修饰小鼠的ES细胞系都是基因型雄性(XY)ES细胞系。因此，在F0代中，所有XY动物都是雄性。大多数遗传修饰通过靶向XY ES细胞执行，以产生两种现有等位基因之一的修饰，即供体小鼠ES细胞对于遗传修饰是杂合的。然而，通常希望获得对于遗传修饰是纯合的小鼠。因为基本上没有完全ES细胞衍生的雌性小鼠在包含该修饰的F0代中出生，所以F0雄性一般与雌性(例如匹配的近亲繁殖的雌性)交配，以生成其中至少一个雌性(F1雌性)对于遗传修饰可能是杂合的一窝动物。随后使杂合F1雌性与F1杂合雄性互交，以获得纯合后代。此类交配需求代表昂贵和费时的步骤。希望在F0代中生成交配对，或至少生成大部分或完全衍生自供体(XY雄性)ES细胞的F0雌性。

本领域存在关于由供体雄性(XY)ES细胞和宿主胚胎在F0代中制备能育的雌性动物的方法和组合物的需要。

发明概述

在一个方面，提供了用于由XY供体细胞制备能育的雌性非人动物的方法，其包括：(a)将非人XY供体细胞引入非人宿主胚胎内，以形成嵌合胚；和(b)使该嵌合胚孕育，以形成非人雌性动物，其中所述非人雌性动物是XY并且在达到性成熟后是能育的。

在一个实施方案中，非人动物是小鼠。

在一个实施方案中，非人XY雌性动物在F0代中形成。在一个实施方案中，在F0代中的非人雌性XY动物是小鼠且具有100％衍生自供体细胞的毛色。在一个实施方案中，在F0代中形成的非人雌性XY动物至少90％、92％、94％、96％、98％或99.8％衍生自XY供体细胞。在一个实施方案中，在F0代中的非人雌性XY动物约100％衍生自供体细胞。在一个实施方案中，宿主胚胎胎细胞对F0代中非人雌性XY动物的贡献通过定量测定法进行测定，所述定量测定法能够检测2,000中的1个细胞(0.05％)，并且没有雌性XY动物的组织对于宿主胚胎细胞贡献是阳性的。

在一个实施方案中，供体细胞包含遗传修饰。在一个实施方案中，遗传修饰包含内源核酸序列整体或部分的缺失；一个或多个核酸的取代；内源核酸序列例如基因整体或部分由异源核酸序列的替换；敲除；和/或敲入。

在一个实施方案中，该方法进一步包括使对于遗传修饰杂合的F0代XY雄性与对于遗传修饰杂合的F0代XY雌性(例如同胞)交配，并且由所述交配获得对于遗传修饰纯合的F1代动物。

在一个实施方案中，在引入宿主胚胎内之前，将XY供体细胞维持在包含基础培养基和补充物的培养基中，其中所述基础培养基显示选自下述的特征：(a)约250-310mOsm/kg的摩尔渗透压浓度；(b)约11-13mS/cm的导电性；(c)浓度约60-105mM的碱金属和卤素的盐；(d)约20-30mM的碳酸盐浓度；(e)至多约85-130mM的碱金属卤盐和碳酸盐总浓度；和(f)其组合。

在一个实施方案中，补充物包含用于维持在培养中的ES细胞的组分。在一个实施方案中，补充物包含胎牛血清(FBS)、谷氨酰胺、抗生素、丙酮酸盐、非必需氨基酸、2-巯基乙醇和LIF中的一种或多种。