[发明专利]一种选择性扩增RNA的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和医学领域，具体涉及一种选择性扩增RNA的方法。

背景技术

在分析基因表达时，常规方法抽提RNA的样本，经常会遇到如何排除DNA干扰和污染的问题。通常会使用DNA酶处理，以保证RNA检测结果的真实性。大量的RNA样本还可以忍耐由于DNA酶处理所造成的样本损失，但是小量的RNA，单细胞的RNA样本分析则不是有效方法。珍贵的小量RNA或单细胞RNA，需要做多种基因表达分析时，通常需要对样本做基因扩增。扩增RNA的方法通常有以T7为基础的cRNA扩增和DNA多聚酶反应(PCR等)为基础的DNA扩增，但从原理上不能解决DNA的干扰或污染问题。一些利用DNA和RNA杂交探针扩增cDNA的方法，扩增时，DNA结合部分在一定温度下，难以展开，造成很多的非特异性产物。

发明内容

本发明的目的在于针对上述不足，提出一个可靠的选择性扩增RNA，而不扩增DNA的方法。

本发明采用的技术方案是：

一种选择性扩增RNA的方法，包括以下步骤：

(1)由cDNA合成探针结合到RNA模板上，在有RNA转录酶的条件下，合成第一链cDNA；

(2)在有RNA酶的条件下，对结合的RNA进行切割；

(3)在有DNA合成酶的条件下，合成第二链cDNA；

(4)在RNA转录酶存在的条件下，合成cDNA合成探针中RNA部分的cDNA；

(5)在RNA酶存在的条件下，酶切结合的cDNA合成探针的RNA部分；

(6)在cDNA扩增探针存在的条件下，cDNA扩增探针结合到空出的部位，在DNA合成酶(DNAPolymerase)的作用下,扩增cDNA产物；

(7)通过改变cDNA扩增探针和cDNA合成探针的核苷酸的相同序列程度，可调式cDNA扩增的温度条件。

进一步地，所述cDNA合成探针是一种由DNA和RNA片段连成的杂交探针，定位性或随机性结合的探针。

更进一步地，所述cDNA合成探针的DNA部分是和要扩增的RNA有配对结合的，其RNA部分原则上是整个RNA样本中没有完全一样的，序列结构特殊；

所述cDNA合成探针的DNA部分是用来合成RNA的第一和第二cDNA链，其RNA部分是为了在合成的第二cDNA链上带有该RNA配对结构的cDNA，作为cDNA扩增的结合点和启动点。

优选地，为达到高效、全面扩增RNA的目的，需要连续合成第一和第二cDNA链，以提高探针模板的合成效率。

进一步地，所述cDNA扩增探针也是一种DNA和RNA片段连成的杂交探针，而且cDNA扩增探针和由cDNA合成探针可有一个碱基或多个碱基不配对。

优选地，所述要扩增的RNA样本可以为RNA样本、多细胞或者为单个细胞。

优选地，如果为RNA样本，可以调制在蒸馏水或缓冲液中；如果是多细胞或者单细胞，则可以调制在细胞裂解液或缓冲液中。

进一步地，如果为RNA样本，还包括定量小样本的RNA或裂解细胞处理，合成第一cDNA链、合成第二cDNA链以及扩增cDNA步骤。

优选地，所述该扩增法是线性扩增，扩增后的产物是cDNA，扩增的产物可以直接用于PCR，定量PCR或各种基因芯片分析。

进一步地，所述该扩增法可以扩增样本中所有的、不同大小的RNA，或者设计定位的扩增探针，扩增所需要扩增的RNA。

cDNA扩增中使用cDNA合成探针，RNaseH,cDNA扩增探针，DNA链分离合成酶相配合，而达到高效扩增的目的。cDNA扩增还包括使用单链DNA结合蛋白质结合扩增后的cDNA产物，使cDNA扩增反应有效地、长时间地进行。