[发明专利]一种核酸分子低穿孔速度的纳米孔测序方法及其专用的纳米孔器件

说明书

技术领域

本发明涉及一种核酸分子低穿孔速度的纳米孔测序方法及其专用的纳米孔器件，属于材料测试领域。

背景技术

基于固态纳米孔器件的DNA单分子探测分析被认为是最有希望实现第三代快速低成本人类基因测序(在24小时内花费1000美元以下实现单个人的基因组测序)的技术路线之一，成为目前研究和应用探索的热点，除哈佛大学、波士顿大学、布朗大学、加州理工学院、荷兰代尔夫特工业大学等研究小组外，IBM公司也在2009年10月宣布加入下一代人类基因组测序‐1000美元计划，以基于纳米孔器件的测序技术为实现方法，使纳米孔的研究由基础研究开始走向应用(D.Branton,et al.Nature Biotechnology26(10),1146(2008)；M.Zwolak and M.Di Ventra,Reviews of Modern Physics 80(1),141(2008).)。通过在溶液中电泳驱动分子穿过一个纳米尺度的孔可以实现基于纳米孔器件的单分子探测和分析能力。在纳米孔的有限空间里可以通过各种手段对大量分子进行快速的分析，当高聚物分子穿过纳米孔时，高聚物分子的结构信息和探测的信号特征有一一对应关系。利用该特性可以直接对数千碱基对长度的单链DNA分子进行表征，避免了扩增或标记实验准备环节，使得快速低成本DNA测序技术成为可能。目前阻碍这一技术长足发展的最大困难在于在电场驱动电压下，DNA穿孔速度过快，超出了通用仪器的分辨率，从而无法实现对单碱基的差别进行识别。

目前国际上较为常用的实验技术是在纳米孔两端加一个电压，通过电场驱动，使DNA分子从孔一端电泳通过纳米孔，在外电路收集的离子电流会出现一个突然下降，电流的突然下降值和阻滞时间，可以对应DNA的生物学信息。但是单纯使用电场调节，DNA的穿孔速度太快，基本在一个碱基一微秒的量级，而目前仪器的最小分辨率为4微秒，也就是说，如果想要区别不同碱基之间的差别，通过现有手段，时间分辨率是无法达到的。要提高时间分辨率，就必须使DNA分子的穿孔时间延长，有效减慢DNA在孔中的运动速度。减慢DNA的穿孔速度，才有可能实现对不同碱基的分辨。美国Boston College的Amit Meller等人通过改变Cis和Trans腔填充的溶液盐浓度，可以在5nm的硅化氮(SiN)纳米孔中，实现DNA分子毫秒量级的穿孔过程(M.Wanunu,W.Morrison,Y.Rabin,A.Y.Grosberg and A.Meller,Nature Nanotechnology,5,160,(2010))。但是他们对产生这种现象的机理解释不清楚，而且他们使用的纳米孔很小，DNA与纳米孔壁之间的相互作用可能会起作用，而这对实验的可控性大打折扣。而且直径很小的纳米孔在实验实现起来非常困难，成功率很低。

美国阿肯色大学的Jiali Li等通过在溶液中加入甘油，可以增加DNA的穿孔时间，但是实验条件要求非常苛刻，对实验技术要求很高(D.Fologea,J.Uplinger,B.Thomas,D.S.McNabb,and J.L.Li,Nano Letters 5,1734(2005))。而且随着甘油的增加，导致溶液粘滞系数增加，DNA穿孔阻滞电流值幅度下降，这样测试的信噪比下降，导致测量误差增大。另外可以通过降低电压，使DNA穿孔速度减慢，但是电压降低导致电流信号降低，信噪比变差，导致测量非常困难。可以看到现有的很多减慢DNA穿孔速度的做法都是在牺牲信噪比的基础上才有可能实现，这样对准确测量信号增加了很大难度，不容易得到准确相关的生物学信息。

发明内容

本发明的目的是提供一种核酸分子低穿孔速度的纳米孔测序方法及其专用的纳米孔器件，本发明在保证了不影响测量信号信噪比的前提下，以琼脂糖凝胶修饰固态纳米孔薄膜作为减速器件，有效减慢了核酸分子在纳米孔中运动的速度，以提高纳米孔器件的时间分辨率。

本发明提供的核酸分子低穿孔速度的纳米孔测序方法，包括如下步骤：将待测的核酸分子加入到盛有电解液的纳米孔测序装置中，所述纳米孔测序装置包括：设有正极和负极的电解池以及分隔所述电解池正极和负极的一面覆盖有琼脂糖凝胶层的固态纳米孔薄膜；将所述核酸分子置于所述电解池的负极腔室；测定时，在正极和负极间施加电压，作为核酸分子穿孔的驱动电场。

上述的方法，所述核酸分子可为DNA、RNA或肽核酸，所述DNA可为单链的DNA或者双链的DNA。