[发明专利]一种利用卵泡抑素Follistatin促进绵羊体外胚胎发育的方法

权利要求书

1.一种利用卵泡抑素Follistatin促进绵羊体外胚胎发育的方法，其特征在于：该方法步骤如下：

（1）在绵羊屠宰场获取宰杀后30分钟以内的绵羊卵巢，置入温度在30-35℃，含1000IU/ml青霉素和1000IU/ml链霉素的生理盐水中，3-5小时内用生理盐水清洗3-4次；

（2）然后，用吸有2ml抽卵液注射器抽吸卵巢表面2-5mm大小的卵泡，将注射器内回收的卵泡液置于器皿中，在显微镜下捡出卵母细胞，用体外成熟液洗涤3-5次，备用；

（3）将步骤（2）中选择的卵母细胞，在条件为5% CO₂，95%空气，温度为38.6℃的CO₂培养箱内培养22-24小时，用绵羊体外受精液洗涤2-4次，按25-30枚/滴的密度加入装有体外受精液的液滴内，备用；

（4）将解冻后的冻精，放入装有体外受精液的试管内，CO₂培养箱内培养20-25分钟，取上清液，以1500转/分钟的转速离心4-5分钟弃去上清液，用剩余的精子沉淀进行密度计算，按2-4×10⁶个/ml的密度加入步骤（3）的体外受精液滴，与卵母细胞共同孵育；

（5）将步骤（4）中受精20-22小时的早期胚胎取出，移至含有10μg/L Follistatin的体外培养液IVC1内洗涤3-4次，并再次培养24-26小时；

（6） 将步骤（5）中在IVC1内培养24-26小时后的胚胎取出，再用常规的体外培养液IVC2洗涤3-4次，统计卵裂率，并继续培养，144-168小时后统计囊胚率。

2.根据权利要求1所述的一种利用卵泡抑素Follistatin促进绵羊体外早期胚胎发育的方法，其特征在于：所述的抽卵液为：TCM199-hepes+1mg/mlPVA+0.7 mg／ml肝素钠；

体外成熟液（IVM）为：TCM199-HCO₃+10%FBS+0.05IU/ml FSH+0.05IU/ml LH+1μg/ml雌二醇＋24.2μg/ml丙酮酸钠+0.1mM/L 半胱氨酸+10ng/mlEGF+100IU/ml青霉素+100IU/ml链霉素；

体外受精液(IVF)为：SOF+20%FBS+6IU/ml肝素钠+100IU/ml庆大霉素；

体外培养液1（IVC1）为：SOF+3mg/ml BSA+10μg/L Follistatin；

体外培养液2（IVC2）为：SOF+3mg/ml BSA；

其中所述合成输卵管液（SOF）为：6.29mg/ml NaCL +0.534 mg/ml KCL+0.162 mg/ml KH₂PO₄+0.6ul/ml乳酸钠+0.089mg/ml MgSO₄+2.1mg/ml NaHCO₃+0.0357mg/ml丙酮酸钠+0.299mg/ml CaCL₂·2H₂O。